Name: isolation and culture of dissociated sensory neurons from chick embryos
Uploaded: 2014-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
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私たちは、この紙の上で洞察に満ちたコメントをアリソンフィルブリック、ベリンダBarbagalloとマイケル·フランシスに感謝したいと思います。この刊行物で報告された研究は、MLLに授与R15 AREA賞1R15NS070172-01A1によってサポートされていました。

1。カバースリップの準備：アシッドウォッシュと焼く<ol><li>解剖（ステップ2）の前に少なくとも2日間、カバーガラスを準備するには、次の手順を開始します。オイル、徹底的にきれいなカバースリップを除去するための酸洗浄ステップを実行します。 </li><li>縦にカバースリップを配置して互いに接触するのを防ぐ磁器ホルダーに用紙をカバースリップ。 2 M塩酸（HCl）を充填したガラス組織学容器にホルダとカバースリップを沈める。磁器ホルダーが使用できない場合あるいは、広がっ〜20カバーガラスを水平方向に100mmのガラス製ペトリ皿の底をカバーし、2 M HCl中でカバースリップを水没する。 </li><li>ドラフト内でロッカー·テーブル上の（酸中に沈めカバースリップで）ガラス容器を置き、室温で少なくとも5時間、穏やかに振動を可能にする。あるいは、酸洗浄は、同じ条件下で一晩カバースリップ。 </li><li>洗浄は、ロードされた磁器ホルダーを転送することにより、蒸留H 2 O（のdH 2 O）を用いてカバースリップのdH 2 Oで満たされた清浄なガラス組織学コンテナに2MのHClからのカバーガラスと代わりに、カバーガラスとガラスペトリ皿から2MのHClをデカントとDH 2 Oで補充</li><li>再びのdH 2 Oをデカントし、新鮮なのdH 2 Oでガラス容器を再充填することによって洗浄する3迅速な洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。 </li><li>ロッカーの上に（カバーガラスとのdH 2 Oで）ガラス容器を返すことによって、より長い洗浄レジメンを開始します。室温で10〜30分間、穏やかに撹拌を可能にします。その後、のdH 2 Oをデカントし、新鮮なのdH 2 Oを追加少なくとも10回の洗浄の合計のため繰り返します。別の方法として、一晩洗浄を続ける。 </li><li> 350℃に予熱した炉に洗浄し、カバースリップを置きます。磁器ホルダーを使用している場合、のdH 2 Oを充填したガラス容器からホルダーを削除して、直接、炉内にカバースリップでホルダーを配置します。ガラスシャーレを使用している場合、のdH 2 Oをデカントし、furnacにカバーガラスをガラス皿に置くメール。 </li><li>焼くは350℃で少なくとも5時間、または一晩カバースリップ。 </li><li>ベーキングが完了した後、細かい鉗子で磁器ホルダーからカバースリップを除去し、無菌の100mmのガラスシャーレに入れます。もともとガラスシャーレに磁器ホルダーに入れていなかったカバースリップのままにしておきます。 </li></ol> 2チック解剖とのDRGの単離<ol><li>肥沃外し、（緩やかに揺り動かしながら37から38.5℃に維持）インキュベーターから白色レグホンひよこの卵を上演した。 注：これまでの研究では、DRGを単離するための胎生7-10を使用している2,8,11-13,16。 </li><li>層流フード内の選択された卵を置きます。滅菌溶液や楽器との層流フード内で無菌条件下で下記のすべての手順を実施する。 37℃の水浴中で前加温すべての溶液。 </li><li>プラスチック100ミリメートルペトリ皿に卵と場所の内容をクラック。別の100ミリメートルのペトリ皿に胚を転送するために、標準的な鉗子を使用してください。 </li><li&gt;をパスツールピペットを使用して、ウェットティッシュを維持するためにペトリ皿に温め、1×PBSを加える。細かい鉗子で首をつまんで胚を首を切る。別のきれいな100ミリメートルペトリ皿に体を転送します。 </li><li>ウェットティッシュを維持するために、パスツールピペットを用いて皿暖かいF12HS10（ハムF12、10mMのHEPES、100単位/ mlのペニシリン、0.1 mg / mlのストレプトマイシン、10％ウシ胎児血清）を加える。その背側（ 図1A）に胚を配置するために鉗子を使用してください。 </li><li>層流フード内で両眼立体視の解剖顕微鏡上に胚組織を含む100ミリメートルのプラスチック製のペトリ皿を置きます。心臓、肺および他の器官を露出させるために開発し、真皮をつまんで首に尾からの垂直正中切開を作るために細かい鉗子を使用してください。別の方法として、内臓を露出させ、小さな涙のシリーズを作る。 </li><li> 、a）の首をつかみ、b）は、心臓のすぐ優れた大動脈または他の組織をつかみ、尾の方に引っ張る：静かに滅菌細かい鉗子の2セットを使用する動物を骨抜き。 </li><li>組織へのパスツールピペットを用いて、暖かいF12HS10を適用します。発展途上リブ、脊柱とDRGを（ 図1B-1D）を露出するために、残りの心血管系、呼吸器や消化器官を取り除くために鉗子を使用してください。 </li><li>解剖顕微鏡下で、さらに内臓を除去し、肋骨に劣る腰椎脊柱の両側に沿ってのDRGを収集するために細かい鉗子を使用しています。胚から無傷のDRGを摘採によってDRGにを収集します。ピンチと脊髄に向かってDRGからのアクセスと周辺部、あるいはその逆に向かって、DRGから届く発展途上の神経をつかん根を断つ。 </li><li>温かいF12HS10で満たされた35mm培養皿に、無傷のDRGを置きます。このような微細な鉗子でつまんで35mm皿にそのままのDRGから、DRGをに付着している可能性があり、背側または腹側根のような余分な組織を取り除きます。 </li><li>腰部よりも優れたDRGを取得するには、胸部の腹側半分を削除し、チェルビCAL脊柱。これは、上頸部と上腰部内の別カットにおける脊髄軸に垂直な発展脊柱にカットすることによって行われます。その後、カットは右と脊柱の左側に沿って脊髄軸に平行にする。が公開に脊髄（ 図1E-1F）を公開し、胚から脊柱の腹側半分を持ち上げます。 </li><li> DRGをへの容易なアクセスを許可するには、細かい鉗子で脊髄をつかんで胸部および頸髄を削除します。脊柱から脊髄を持ち上げるために鉗子を使用してください。近似​​として、胸髄は、リブのレベルにあり、頸部がリブよりも優れている。 </li><li>細かい鉗子で無傷の胸部および子宮頸部のDRGを収集し、他のDRGを暖かくF12HS10に配置します。 DRGをに付着する余分な組織を取り除きます。 </li><li>助けるためにF12HS10で新しいガラスパスツールピペットの内部をすすぐピペットの壁に付着するのを防ぐのDRG。無菌15ミリリットルコニカルチューブに小さなペトリ皿からすべてのDRGとF12HS10を転送し、すぐにステップ3に進むことすすいでピペットを使用してください。 注：追加の胚のDRGの数を増やすこと解剖することができる。 DRGを、ステップ3の準備が整うまで、37℃でF12HS10に保管してください。 </li></ol> 3解離、豊か、そして培養DRGニューロン - パート1 <ol><li>無傷のDRGを持つ場所コニカルチューブ遠心機に、静かに2〜3分間（200×gで）をスピン。 DRGをチューブの底に沈んできたことを確認します。いない場合は、再度スピン。 </li><li>ピペットを用いて、静かに邪魔されずにDRGペレットを残し、F12HS10を削除します。のDRGのペレットを追い出し、1倍、カルシウムとマグネシウムを含まない（CMF）2mlのPBSを追加します。再びスピン無傷DRGペレットを残しながら、CMF PBSを削除します。次のステップでトリプシン消化を妨害するF12HS10におけるウシ胎児血清を除去し、合計3回の洗浄のためのこの洗浄ステップを繰り返します。 </li><li> 2ミリリットルCMFのPBSとのDRGを含む15mlチューブに温め2mlのトリプシンを追加します。解離した細胞へのDRGを消化するために10〜15分間37℃の水浴中に置きチューブ。 </li><li>インキュベーションの間、F12H +サプリメントを含む培地を加える（ハムF12、10mMのHEPES、100単位/ mlのペニシリン、0.1 mg / mlのストレプトマイシン、10ng / mlのNT3、10ng / mlのNGF、200mMのL-グルタミン及びN2）と暖かい37℃の水浴中。典型的には、総培地の10mlを、一次感覚ニューロンの4-5 35mm皿で十分である。また、コーティングカバースリップ（ステップ4）のためにラミニン-1の解凍を開始します。 </li><li>静かに粉薬のDRG P1000ピペットでトリプシン溶液中で、視覚的に無傷のDRGがないことを点検します。無傷のDRGは、もはや目で見られるまで粉砕してを続けていない、および/または無傷のDRGが解離されるまで、37℃の水浴中に長いトリプシンインキュベーションを可能にします。損傷からDRGニューロンを保護するために、粉砕して中に気泡を回避し、&lt;30分にトリプシン消化を制限する。 </li><li> Centrifug解離したDRGを含有するペレットを形成するために、3〜5分間200×gでトリプシンの電子管。ペレットが形成されるまで、必要に応じてより長いスピン。 </li><li>慎重にペレットを中断することなく、トリプシンを吸引。ペレット化しF12HS10の2ミリリットルを追加。静かにP1000のピペットチップでのDRGを粉砕する。 </li><li> 100mm培養皿に15ミリリットルコニカルチューブからすべての内容を転送します。 10ミリリットルの合計時に8ミリリットルF12HS10でチューブをすすぎ、培養皿に転送、2ミリリットル。このすすぎ工程は、管の壁に付着して残っている可能性があり、細胞を収集するのに役立ちます。 </li><li> 3時間加湿した37℃のインキュベーター内に（10ミリリットルF12HS10とし、DRG細胞を解離さ）100mmの培養皿を置きます。 NOTE：HEPESは、CO 2の不在下で培地のpHを緩衝するため、CO 2インキュベーター中で必要とされない。インキュベーションの間、グリア細胞は、組織培養プラスチックの表面に結合し、ニューロンが緩くグリア床に付着する傾向がある。 </li></ol> 4。コーティングアシッドウォッシュラミニン-1とし、焼きカバースリップ<ol><li>氷上で凍結したラミニン-1の無菌アリコートを解凍する。 </li><li>無菌条件下では、ラミニン-1の50μlアリコートに無菌×PBS中の1ミリリットルを加える。 </li><li> 280nmでラミニン-1の吸光度の値を取得するために、分光光度計を使用してください。ラミニン-1の濃度を測定するために、以下の式でこの値を使用します。 </li></ol> ABS 280 =（濃度mg / mlで）*（タンパク質の吸光係数） ラミニン-1の吸光係数は0.86である。 <ol start="4"><li>無菌条件下で、1 mg / mlのおよび20 mg / mlの濃度を得るために1X PBSでラミニン-1を希釈する。これら二つのインキュベーション7,8,10後にカバースリップ（それぞれ30 ngの/ cm 2であり、300 ngの/ cm 2の ）と結合したラミニン-1の10倍の差を達成するために、ラミニン-1の濃度を適用使用してください。 </li><li>層流フードでは、一方の酸洗浄及び焼きCを配置する微細なピンセットを使用し1 35mm培養皿の底にoverslip。必要な食器の数を得るために必要に応じて繰り返します。 </li><li>さらに滅菌を確実にするために20〜30分間UV光にカバースリップを施す。このステップの間に皿のふたをオフにしてください。 </li><li>各ガラスカバースリップに準備されたラミニン-1の400を添加する。カバースリップの完全なカバレッジを確保するために、ラミニン-1を広めるためにピペットチップを使用してください。表面張力は、ラミニン-1がカバースリップ上に残り、必要とされる培養皿の底に広げないようにすることができます。 </li><li>皿の上に蓋を置き、ラミニン-1は、室温で2〜3時間インキュベートすることができます（3時間が最適である）。 </li><li>ラミニン-1インキュベーション後、層流フード内で無菌PBSで無菌技術を使用してカバースリップをすすぐ。カバースリップ上で溶液を除去し、PBS400μlのを追加します。 5〜10分待ちます。 3回のすすぎの合計に対して、この手順を繰り返します。 </li><li>最後のすすぎの後にカバースリップ上で、PBSのままにしておきます。すすぎ時の表面張力を壊さないでください。また、カバーガラスを乾燥させないでください。レcoverlipに解離したニューロンをめっきする直前まで、上のaveの蓋。 </li></ol> 5。解離、豊か、そして培養DRGニューロン - パート2 <ol><li>インキュベーション後、穏やかに解離したDRG細胞を含有する100mm皿の底をすすぎ、10 mlの滅菌ピペットを使用する。 〜45°の角度で皿を持ち、静かに、約3分の1皿の上に7ミリリットルを追放、その後、ピペット補助によりF12HS10の〜7ミリリットルを引っ張る。優しくニューロンを追い出し、5回繰り返します。 </li><li>皿を回転させ、皿の別の3分の1に、別の6回のすすぎのために、手順をすすぐ繰り返します。皿の3分の1を、残りのために再度手順を繰り返します。このように、優しくニューロンを除去するためにF12HS10と皿の底面全体をすすぎ。 </li><li>同じピペットを用いて、15​​の円錐管に100mmディッシュからF12HS10含有ニューロンを転送します。細胞をペレットに200グラムで5〜10分間遠心。 </li><li>邪魔されずにペレットを残し、F12HS10を削除します。温めF12H +サプリメントの2ミリリットルでペレットを再懸濁する。 </li><li&gt;は細胞密度を決定するために、血球計数器を使用してください。 </li><li>所望のめっき濃度（1μg/ mlのラミニン-1および20μg/ mlラミニン-1 8,16で被覆されたカバースリップのために40,000細胞/ mlのコーティングされたカバースリップ用12万細胞/ ml）を得F12H +サプリメントと同様に、必要な細胞を希釈する。 </li><li>ラミニン被覆カバースリップからPBSを取り出し、すぐにカバーガラス上の細胞の400μlのを置く。慎重に加湿し、37℃の細胞培養インキュベーターに皿に移す。少なくとも1時間インキュベートし、最大3時間まで神経細胞がラミニン-1に準拠することを可能にすることを許可する。 </li><li>無菌条件下では、優しくF12H +サプリメントの1.6ミリリットルでニューロンを含む35mm皿にあふれる。 注：この時点では、カバーガラス上で表面張力が破壊することができる。ニューロンは十分にカバースリップ上ラミニン1に付着した。 </li><li>インキュベーターで一晩インキュベートした細胞を返します。次の日に免疫細胞化学などの実験を行う。 </li></ol> 6。私はmmunocytochemistry <ol><li>免疫細胞化学の前に、37℃の水浴中に温かい固定溶液（4％パラホルムアルデヒド、30％のスクロース2X PBS）。 注：細胞を固定する前に、そのようなネトリン-1はMn 2 +、ソニックヘッジホッグ、セマフォリンおよびエフリン16,29-31などの各種試薬で処理する。 </li><li>ゆっくり培養皿からF12H +サプリメントの2ミリリットルの1ミリリットルを削除します。優しく暖め固定剤溶液1mlを加える。 10〜15分間室温でインキュベートすることを許可する。 </li><li>慎重に固定溶液を除去し、2mlのPBSを追加。 PBS等の適用開始による固定された細胞の可能性脱落を回避すること、皿の縁に向かって解決策を適用します。 5分間室温でインキュベートする。 </li><li> 5回の洗浄の合計PBS洗浄を繰り返します。細胞は免疫細胞のいずれかのステップの間に乾燥させないでください。 </li><li> PBSを除去します。ブロッキング溶液を1ml（0.1％トリトン-X、1X PBS、5％正常ヤギ血清）を適用する。室温で1時間インキュベートする。あるいは、表面分子を染色する、液8ブロッキングトリトン-Xを使用しないでください。 </li><li>製造者の推奨に従って、ブロッキング溶液に一次抗体を希釈します。 NCAM活性化β1インテグリン16に対する抗体500：1を使用してください。ブロッキング溶液を除去し、一次抗体溶液1mlを添加して、室温で1時間インキュベートするか、4℃で一晩。 </li><li>一次抗体溶液を除去し、1×PBS 2 mlを加える。室温で5〜10分間インキュベートする。 4回のPBS洗浄の合計のため繰り返します。必要に応じて洗浄は、拡張することができます。 </li><li>ブロッキング溶液中1,000：二次抗体1に希釈する。 PBSを取り外し、1ミリリットルの二次抗体溶液を追加し、室温で1時間インキュベートする。 注：二次抗体は光に敏感である。これ以降、なるべく暗所にソリューションや細胞を保管してください。 </li><li>二次抗体溶液を除去し、以前に行ったように、1×PBSで5回すすいでください。 </li><li> Fluoromountの〜60-80μlの適用顕微鏡スライド上にG。細かい鉗子を使用して、静かに顕微鏡スライド上Fluoromount Gに皿と下カバースリップからカバースリップを持ち上げます。空気の泡を避けてください。 </li><li> Storeは暗闇の中で、4℃で水平にスライドする。 12〜24時間後、Fluormount Gが重合するとカバーガラスをしっかり顕微鏡スライドに添付されます。画像セルこの重合工程が完了した後。 </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+distal+axons+is+not+required+for+growth+cone+responses+to+guidance+cues.">Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).</li><li>Condic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neuronal+regeneration+induced+by+transgenic+integrin+expression.">Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression.</a> Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).</li><li>Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+supports+the+survival+of+developing+muscle+sensory+neurons+in+culture.">Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).</li><li>Toyofuku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FARP2+triggers+signals+for+Sema3A-mediated+axonal+repulsion.">FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).</li><li>Steinmetz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+enhancement+of+the+intrinsic+growth+capacity+of+sensory+neurons+combined+with+the+degradation+of+inhibitory+proteoglycans+allows+functional+regeneration+of+sensory+axons+through+the+dorsal+root+entry+zone+in+the+mammalian+spinal+cord.">Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

ここでは、単離するための詳細なプロトコールを提示し、培養ニワトリ胚からの感覚ニューロンを解離さ。この手順では、in vitro 7,8,10,16 におけるロバスト成長ニューロンの濃縮集団を生成します。多数の細胞および分子技術がここに記述されている免疫細胞を含む、これらの培養ニューロンに適用することができる。このプロトコルは、最近、定量的感覚成長円錐8,...

ニューロンは、感覚、視覚、運動運動、学習、およびメモリを含む、さまざまな機能に不可欠な情報を伝達する複雑な細胞である。他の細胞型からのユニークな、ニューロンは、通信のための不可欠な神経の高速道路を形成するために、軸索と呼ばれる、アーム状のプロセスを拡張します。成長円錐と呼ばれる成長の軸索の先端に位置して開発専門のコンパートメント、中、その適切な宛先に軸索をリードして、細胞外手がかりのコンサートをナビゲート。成長円錐ナビゲーションの根底にある複雑な分子メカニズムは完全には理解されていない。より良いこれらのメカニズムを理解するために、研究者らは、in vitro環境で定義され、簡略化のニューロンを研究するための細胞培養モデルを使用している。神経分化2、細胞骨格のダイナミクス、エンドサイトーシスおよび人身売買、デンドライト：文化1に留学ニューロンは、ニューロンを含む細胞生物学の理解において大きな進歩をもたらしたレギュレーション3,4、軸索再生5、そのような神経障害6などの臨床症状。加えて、培養神経細胞は、成長円錐の運動性のタイムラプス分析などの免疫細胞化学、細胞表面共免疫沈降、ウエスタンブロット、トランスフェクション、RNAiは、ライブイメージングを含む、研究技術の広い範囲に非常に適している。このように、一次ニューロンを培養したニューロンの細胞生物学の多くの側面を解明するための強力なアプローチである。 細胞培養モデルは、環境条件や変数を詳細に制御した研究者を提供しています。例えば、ニューロンがメッキ（および上に成長）された基質は、容易に操作することができる。ここでは、二つの異なる基質、低ラミニン-1濃度が1およびラミニン-1の飽和濃度で他を生成するための詳細な手順を提供する。驚くべきことに、同じ分子の異なる濃度は、劇的な効果を持つことができ内部のニューロンの状態だけでなく、それらの細胞表面組成に。例えば、インテグリンのcAMPおよび表面レベルの細胞内レベルは、これらの2つの基層7,8上にめっきニューロンが有意に異なっている。追加の研究は、フィブロネクチンおよびコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを含む他の分子は、細胞表面分子の発現および神経運動性7-11に影響を与えることが示されている。また、このようなニューロトロフィンおよびニューロトロピン等の水溶性分子はまた、細胞膜の組成および神経運動性12-16に影響を及ぼし、容易かつ正確に細胞培養モデルで操作することができる。 ここでは、単離するための方法が記載されているし、培養ニワトリ胚から感覚ニューロンを解離さ。この手順は、軸索伸長5,7,8,10,11,16-21含む神経生物学における重要なブレークスルーを製造するために使用されており、神経節細胞22を分離するように設計された手順を改変した。ありこの手法にはいくつかの利点。まず、ひよこ後根神経節（DRG）の開発の多くの機能はよく出産、軸索伸長のための時間枠を含む特徴とし、タンパク質発現は、このように試験管内実験で有益構築するための有益な基礎を提供し、2,23-28プロファイル 。第二に、神経細胞培養は研究者がより直接的に（神経細胞および非神経細胞を含む）は、無傷のDRG外植片および/または解離神経細胞および非神経細胞の両方を含む混合培養を用いて別のアプローチと比較して、神経細胞を研究することを可能に解離。第三に、ここで説明する手順は、簡単で安価で学部生に適している。したがって、この技術は、研究ならびに教育目的のために使用することができる。さらに、このプロトコルのマイナーバリエーションはDRGを以外のソースからのニューロンの速い、高収率の精製を可能にする必要があります。例えば、この手順はneuronally ENRを提供するために修正することができるそのような胚前脳や脊髄などの他の組織からの文化をiched。 免疫細胞化学プロトコールは、これらの解離ニューロン培養のために最適化されており、ここでは詳細に記載されている。神経細胞接着分子（NCAM）及びβ1インテグリンに対する二重免疫細胞化学のための手順が提供される。これらの免疫細胞化学的方法から生成されたデータは、培養ニューロン8,16のいくつかの分子の空間パターニングおよび強度を調べるために使用されてきた。

<table><tbody><tr><td>Sterile small culture dishes (35 mm)</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Sterile large culture dishes (100 mm)</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Sterile large Petri dishes (100 mm)</td><td>VWR</td><td>89000-302</td><td></td></tr><tr><td>Glass Petri dish (100 mm)</td><td>VWR</td><td>D108962</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Standard forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>1100-12</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (22 x 22 mm)</td><td>Fisher</td><td>12 518 105K</td><td>0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy</td></tr><tr><td>Porcelin coverslip holder</td><td>Thomas scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham&#039;s F12 media</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>VW3204-1</td><td>use at 2 M, can be used twice before discarding</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution</td></tr><tr><td>Laminin-1</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>Add 72 &amp;micro;l of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>15 ml Conical tube</td><td>cell treat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF 10x</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14080</td><td>used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water</td></tr><tr><td>Ham&#039;s F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Gibco</td><td>10438</td><td>use in F12HS20 at 10%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomyocin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>use 5 ml in 500 ml of F12 media</td></tr><tr><td>NT3</td><td>Millipore</td><td>GF031</td><td>Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 &amp;deg;C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 &amp;deg;C non-defrosting freezer</td></tr><tr><td>NGF</td><td>RnD systems</td><td>256-GF</td><td>Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 &amp;deg;C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>aliquot under sterile conditions, store at -20 &amp;deg;C, use at final concentration of 200 mM in F12H media</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>aliquot under sterile conditions, store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Gibco</td><td>15260</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 &amp;deg;C), cell incubation chamber (humidified, 37 &amp;deg;C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Immunocytochemistry Reagents Table&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Life technologies</td><td>PCN500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Primary Antibody Table&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Antibody against NCAM</td><td>Millipore</td><td>AB5032</td><td>polyclonal</td></tr><tr><td>Antibody against activated &amp;beta;1 ingegrin</td><td>Millipore</td><td>MAB19294</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Secondary Antibody Table&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa 548</td><td>Life technologies</td><td>A11036</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of dissociated sensory neurons from chick embryos

ニューロンは、感覚、運動、移動、学習、およびメモリを含むさまざまな機能のために重要な情報を運ぶ多面細胞である。 生体内で神経細胞を研究することは、それらの複雑さ、彼らの多様かつ動的な環境、そして技術的な限界に挑戦することができます。これらの理由により、in vitroでニューロンを研究することは神経細胞の複雑な謎を解明することが有益で証明することができます。細胞培養モデルの明確に定義された性質は、環境条件および変数を詳細に制御を提供する。ここでは、隔離解離、およびニワトリ胚由来の培養一次ニューロンする方法について説明します。この技術は、迅速で安価であり、ロバスト感覚ニューロンを成長生成する。手順は、一貫して非常に神経細胞について濃縮された培養物を生成し、非常に少数の非神経細胞（5％未満）を有している。一次ニューロンは、したがって詳細な手順二つディスタンを作成するために、未処理のガラスまたは組織培養プラスチックによく接着しないCT、ニューロンのメッキ用の、明確に定義されたラミニン含有基質が記載されている。培養したニューロンは、共免疫沈降、生細胞想像、RNAiを、および免疫細胞化学を含む複数の細胞および分子技術、に非常に適している。これらの培養神経細胞をダブル免疫細胞化学のための手順は、最適化されており、ここに記載されている。

ここで説明するプロトコルは、文化に非常に少ない（ 例えば 、&lt;5％）非神経細胞7,8,10,16と解離胚性感覚ニューロンの濃縮集団を研究者を可能にします。多数のDRGを腰仙部、胸部および頸部から得ることができる。治験責任医師の必要に応じて、これらの異なる解剖学的領域からのDRGを容易に単離することができる。たとえば、 図1は、図1Cおよび1Dお...

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Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

細胞培養モデルは、環境条件を詳細に制御を提供し、したがって、神経細胞生物学の多くの側面を解明するための強力なプラットフォームを提供します。私たちは、隔離解離、およびニワトリ胚の培養感覚ニューロンために、迅速な安価で、かつ信頼性の高い方法を記載する。基質の調製および免疫細胞化学の詳細も提供される。

ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.3K ビュー.  Assumption College. 細胞培養モデルは、環境条件を詳細に制御を提供し、したがって、神経細胞生物学の多くの側面を解明するための強力なプラットフォームを提供します。私たちは、隔離解離、およびニワトリ胚の培養感覚ニューロンために、迅速な安価で、かつ信頼性の高い方法を記載する。基質の調製および免疫細胞化学の詳細も提供される。 

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Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

神経突起伸長アッセイのためのコラーゲンゲルのチックStatoacousticガングリオンと脊髄の外植片の解剖と文化

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

神経科学

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

ラット胚神経細胞の分離と文化：クイックプロトコル

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

ニワトリ胚脊髄スライス培養プロトコル

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

の感覚ニューロンの分離<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em&gt;グルタミン酸作動電流のパッチクランプ記録のために

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

チラリア性神経節ニューロンの分離と培養

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...

Isolation of DRG Neurons and Coculture with Schwann Cell Precursors to Generate Schwann Cells

Source: Tsui, Y, et al. <a href="https://app.jove.com/v/55794">Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells as a Source for the Generation of Mature Schwann Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a procedure for isolating dorsal root ganglion (DRG) neurons from rat embryos and co-culturing them with Schwann cell precursors to generate mature Schwann cells. The isolated DRGs are processed to isolate neurons and glial cells. The isolated cells are cultured to purify the neurons, which are then co-cultured with Schwann cell-like cells (SCLCs) in a co-culture medium. Interaction with the DRG neurons leads to the maturation of SCLCs into Schwann cells.

DRGニューロンの単離とシュワン細胞前駆体との共培養によるシュワン細胞の生成

Generation of Fate-committed Schwann Cells via Coculture with DRG Neurons
1. Preparation of purified rat DRG neurons

	Autoclave all dissection tools ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

神経細胞培養技術

共培養と相互作用の研究

Isolation of Cells from Sensory Ganglia

Source: Kaelberer, M. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53917">A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the isolation of cells from the sensory ganglia of mice. Ganglia are subjected to enzymatic digestion to dissolve the extracellular matrix. Single cells are then collected via filtering through a cell strainer followed by density gradient centrifugation for debris removal. Finally, washing and centrifugation are done to collect the isolated cells for future analysis.

感覚神経節からの細胞の単離

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#8217;s IRB guidelines.
1. Sensory Ganglia Dissociation

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一次神経細胞培養

Isolation and Culturing of Cells from Mouse Embryo Dorsolateral Telencephalons

Source: Landeira, B. S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56063">Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a protocol for isolating and culturing primary cerebral cortex cells from the dorsolateral telencephalon of mouse embryos.

マウス胚背外側末脳からの細胞の単離と培養

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Isolating Cranial Neural Folds From a Chick Embryo for a Neural Crest Cell Culture

Source: Jacques-Fricke, B. T., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63799">Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video illustrates a technique for isolating cranial neural folds from the midbrain region of chick embryos. It presents a detailed dissection process of the neural folds, their placement, and attachment on fibronectin-coated coverslips, followed by the observation of neural crest cell migration from the neural folds.

ニワトリ胚からの頭蓋神経襞の単離による神経堤細胞培養

高度な神経細胞モデル

Isolating and Culturing Chick Embryonic Neurons on a Multi-Electrode Array

Source: Sanchez, K. R., et al., <a href="https://app.jove.com/v/56300">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp.(2018)
This video demonstrates a method to isolate neurons from the forebrain of an early-stage chick embryo and culture them on a microelectrode array to form a neuronal network.

ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養

要約

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