Name: isolation and culture of dissociated sensory neurons from chick embryos
Uploaded: 2014-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos at JoVE.com

Biz bu kağıt üzerinde anlayışlı yorumlar için Alison Philbrook, Belinda Barbagallo ve Michael Francis teşekkür etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen Araştırma MLL layık bir R15 ALAN ödül 1R15NS070172-01A1 tarafından desteklenmiştir.

1. Coverslip Hazırlanışı: Asit Yıkama ve pişirin <ol><li> En az 2 gün önce Diseksiyon (aşama 2) için, lamelleri hazırlamak için aşağıdaki adımları başlar. Yağlar ve tamamen temiz lamelleri kaldırmak için asit yıkama aşamasını gerçekleştirir. </li><li> Dikey lamelleri pozisyonları ve birbirlerine dokunmadan onları engelleyen porselen tutucu Yük lamelleri. 2 M hidroklorik asit (HCI) ile dolu bir cam kap içine histoloji tutucu ve lamelleri batırılır. Porselen tutucu mevcut değilse, alternatif olarak, 100 mm cam Petri kabı alt kapağı ve 2 M HCl lamelleri daldırın 20 lamelleri yatay ~ yayıldı. </li><li> Bir çeker ocak içinde külbütör tablasına (asit içinde daldırılmış lamelleri ile) cam kaba yerleştirin ve oda sıcaklığında en az 5 saat boyunca hafif sallanan sağlar. Alternatif olarak, asitle temizleme, gece boyunca aynı koşullar altında lamelleri. </li><li> Porselen tutucu yüklenen aktarılarak damıtılmış H2O (DH 2 O) ile yıkayın lamelleridH 2 O ile dolu temiz bir cam histoloji kaba 2 M HCI gelen lamelleri ile Alternatif olarak, lamelleri ile cam petri 2 M HCI süzün ve dH 2 O ile doldurun </li><li> Tekrar dH 2 O boşaltılarak ve taze dH 2 O ile cam kap dolum yıkayın 3 hızlı yıkar toplam tekrarlayın. </li><li> Rocker üzerine (lamelleri ile ve dH 2 O) cam kap dönerek uzun yıkama rejimi başlayacaktı. Oda sıcaklığında 10-30 dakika boyunca hafifçe çalkalanarak izin verme. Sonra, dH 2 O süzün ve taze dH 2 O eklemek En az on yıkama toplam tekrarlayın. Alternatif olarak, bir gecede yıkamaya devam. </li><li> 350 ° C&#39;ye ısıtılmış fırın içine yıkanmıştır lamelleri. Porselen tutucu kullanıyorsanız, dH 2 O-dolu cam kabı tutucusunu çıkarın ve sonra doğrudan fırına lamelleri ile yerleştirmeyiniz. Bir cam Petri kullanıyorsanız, dH 2 O süzün ve sobala içine lamelleri ile cam tabak yerleştirinör. </li><li> En az beş saat veya gece boyunca 350 ° C lamelleri pişirin. </li><li> Pişirme işlemi tamamlandıktan sonra, ince forseps ile porselen tutucudan lamelleri çıkarın ve steril 100 mm ebadındaki bir cam Petri kabı içine yerleştirin. Başlangıçta cam Petri kabındaki porselen tutucuya yerleştirildi değil lamelleri bırakın. </li></ol> 2. Civciv Diseksiyon ve DRG&#39;ler İzolasyonu <ol><li> Bereketli Kaldır (hafif hafif sallanarak 37-38,5 ° C&#39;de tutulan) inkübatör Beyaz Livorno civciv yumurta düzenledi. NOT: Önceki çalışmalarda DRG&#39;ler 2,8,11-13,16 izolasyonu için embriyonik gün 7-10 kullandık. </li><li> Laminar akış içinde seçilen yumurta yerleştirin. Steril çözümleri ve araçları ile laminer akış kaputu aseptik koşullarda, aşağıda listelenen tüm işlemleri yürütmek. 37 ° C su banyosunda Pre-sıcak tüm çözümleri. </li><li> Plastik 100 mm Petri kabı içine yumurta ve yer içeriğini çatlak. Başka bir 100 mm Petri kabı embriyo transferi için standart forseps kullanın. </li><li&gt; Pasteur pipet kullanarak, ıslak mendil tutmak için Petri 1x PBS ısındı ekleyin. Ince forseps ile boyun kısma embriyo başını kesmek. Başka bir temiz 100 mm petri vücudu aktarın. </li><li> Sıcak F12HS10 ekleme (Ham&#39;ın F12, 10 mM HEPES, 100 birim / ml penisilin / ml streptomisin,% 10 cenin sığır serumu, 0.1 mg) ıslak doku tutmak için Pasteur pipeti ile çanak. Sırt tarafında (Şekil 1A) üzerine embriyo konumlandırmak için forseps kullanabilir. </li><li> Laminer akış kaputu bir binoküler stereovision mikroskop üzerine embriyonik doku içeren 100 mm plastik Petri kabı yerleştirin. Kalp, akciğer ve diğer organlara maruz gelişen dermis kısma boyun kuyruk dikey bir orta hat kesi yapmak için ince forseps kullanın. Alternatif olarak, iç organların maruz küçük gözyaşı bir dizi yapmak. </li><li> Yavaşça steril ince forseps 2 set kullanın: a) boyun kavramak ve b) kuyruk doğru kalbe hemen üstün aortu veya diğer doku tutun ve çekin,hayvan iç çıkarma. </li><li> Dokuya Pasteur pipeti ile sıcak F12HS10 uygulanır. Gelişmekte kaburga, omurga kolonu ve DRG&#39;ler (Şekil 1B-1D) maruz kalan kardiyovasküler, solunum veya sindirim organları çıkarmak için forseps kullanın. </li><li> Mikroskop altında, daha kaburga alt lomber vertebral kolon, her iki tarafın birlikte DRG&#39;ler organları kaldırmak ve toplamak için ince forseps kullanabilir. Embriyodan sağlam DRG&#39;ler yolma tarafından DRG&#39;ler toplayın. Kıstırma ve omurilik doğru DRG ulaşmak ve çevre ya da tam tersi doğru DRG ulaşır gelişmekte olan sinir kavrayarak kökleri sahip olamazlar. </li><li> Sıcak F12HS10 dolu bir 35 mm kültür çanak içine bozulmamış DRG&#39;ler yerleştirin. Ince forseps ile sıkıştırarak 35 mm çanak sağlam DRG&#39;ler gelen DRG&#39;ler yapışmış olabilir dorsal veya ventral kökleri gibi, herhangi bir aşırı doku çıkarın. </li><li> Lomber bölgeye üstün DRG&#39;ler elde etmek için, torakal ve Cervi&#39;de ventral yarısında kaldırmakcal omurga. Bu, üst boyun bölgesinde omurilik ekseni ile üst bel bölgesinde bir kesim dik gelişmekte belkemiğinin bir kesim yapılarak yapılır. Sonra, kesik sağ ve vertebral kolonun sol kenarlarında omurilik eksenine paralel hale. Açığa omurilik (Şekil 1E-1F) ortaya embriyo, gelen vertebral kolonun ventral yarısını kaldırın. </li><li> DRG&#39;ler kolay erişim sağlamak için, ince forseps ile omuriliği tutarak torakal ve servikal omurilik çıkarın. Vertebral kolonun üzerinden omurilik kaldırmak için forseps kullanabilir. Bir yaklaşım olarak, göğüs omurilik yivlerin seviyesinde ve servikal alan kaburga üstündür. </li><li> Ince forseps ile sağlam göğüs ve servikal DRG&#39;ler toplayın ve diğer DRG&#39;ler sıcak F12HS10 koyun. DRG&#39;ler yapışabilir aşırı doku çıkarın. </li><li> Yardım etmek F12HS10 ile yeni bir cam Pasteur pipet içini durulayınPipet duvarlarına yapışmasını önlemek DRG&#39;ler. Bir steril 15 ml konik tüp küçük bir petri tüm DRG&#39;ler ve F12HS10 transferi ve hemen 3. adıma geçmek için durulanır pipet kullanın. NOT: Ek embriyolar DRG&#39;lerin sayısını artırmak için disseke edilebilir. DRG&#39;ler Aşama 3 için hazır olana kadar 37 ° C &#39;de F12HS10 tutulmalıdır. </li></ol> 3. Ayrılma, zenginleştirilip, ve Kültürleme DRG Nöronlar - Bölüm 1 <ol><li> Sağlam DRG&#39;ler santrifüj içine yavaşça yer ile konik tüp 2-3 dakika boyunca (200 xg) dönerler. DRG&#39;ler tüpün dibine battı onaylayın. Aksi takdirde, tekrar dönerler. </li><li> Bir pipet kullanarak, yavaşça rahatsız DRG pelet bırakarak F12HS10 çıkarın. DRG&#39;lerin pelet yerinden ayrılmasını, 1x kalsiyum ve magnezyum içermeyen (CMF) 2 ml PBS ilave edin. Tekrar Spin ve sağlam DRG pelet bırakarak CMF PBS kaldırmak. , Bir sonraki aşamada bir şekilde tripsin emdirme ile müdahale edecek F12HS10 fetal sığır serumu, çıkarmak için üç kez olmak üzere toplam bu yıkama işlemi tekrar edin. </li><li> 2 mi PBS ve CMF DRG&#39;ler içeren 15 ml&#39;lik bir tüpe ısıtıldı tripsin 2 ml ilave edilir. 10-15 dakika ayrışmış hücrelere DRG&#39;ler sindirmek için 37 ° C su banyosu içinde yer tüpü. </li><li> İnkübasyon sırasında, F12H + ek ihtiva eden ortam yapmak (Ham&#39;ın F12, 10 mM HEPES 100 birim / ml penisilin, 0,1 mg / ml streptomisin 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml NGF, 200 mM L-glutamin ve N2) ve sıcak 37 ° C su banyosu içinde. Tipik olarak, toplam 10 mL ortam içinde birincil duyu nöronlarının 4-5 olarak 35 mm&#39;lik kaplara için yeterlidir. Ayrıca çözülme laminin-1 kaplama lamelleri (adım 4) için başlar. </li><li> Görsel yavaşça çiğnemek P1000 pipet ile tripsin çözeltisi içinde DRG&#39;ler ve sağlam DRG&#39;ler yokluğu için inceleyin. DRG&#39;ler sağlam artık gözü ile görülebilecek kadar öğütme devam edilmesi ve / veya bozulmamış DRG&#39;ler ayrışmış kadar 37 ° C su banyosu içinde daha fazla tripsin inkübasyon için izin verir. , Hasar DRG nöronları korumak öğütüldükten sırasında hava kabarcıkları önlemek ve &lt;30 dakika tripsin sindirimi sınırlamak için. </li><li> Centrifugayrışmış DRG&#39;ler içeren ve pelet oluşturmak için 3-5 dakika boyunca 200 xg&#39;de tripsin e tüp. Pelet oluşana kadar gerekirse daha uzun Spin. </li><li> Dikkatle pelet bozmadan tripsin aspire. Topak haline F12HS10 2 ml ilave edilir. Yavaşça P1000 pipet ile DRG&#39;ler çiğnemek. </li><li> 100 mm kültür çanak içine 15 ml konik tüp tüm içeriği aktarın. 10 ml&#39;lik bir toplam için her seferinde, 2 ml 8 mi F12HS10 ile tüp durulayın ve kültür tabağına aktarın. Bu durulama aşaması, borunun duvarlarına yapışmış halde olabilir hücreleri toplamak yardımcı olur. </li><li> 100 mm kültür tabağına yerleştirin (10 mi F12HS10 ve DRG hücreleri ayrışmış), 3 saat boyunca nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör içine. NOT: HEPES CO2 yokluğunda ortam pH tamponları, çünkü CO2 inkübatör gerekli değildir. İnkübasyon sırasında, glial hücreler, glial gevşek yatağına yapışarak doku kültürü eğilimi plastik ve nöron yüzeyine bağlanır. </li></ol> 4. Kaplama Asit YıkanmışLaminin-1 ve Fırında Lameller <ol><li> Buz üzerinde donmuş laminin-1 steril hacimde çözülme. </li><li> , Steril koşullar altında, laminin-1, 50 ul steril kana 1x PBS 1 ml. </li><li> 280 nm&#39;de, laminin-1 absorbans değerini elde etmek için bir spektrofotometre kullanılır. Laminin-1 konsantrasyonunu belirlemek için, aşağıdaki denklem kullanılarak, bu değeri kullanın. </li></ol> ABS 280 (= konsantrasyonu mg / ml) * (protein yok olma katsayısı) Laminin-1 için yok olma katsayısı 0.86 olduğunu. <ol start="4"><li> , Steril koşullar altında, 1 mg / ml ve 20 mg / ml konsantrasyonları elde etmek için 1X PBS ile laminin-1 seyreltin. Laminin-1 inkübasyondan sonra 7,8,10 lamel (30 ng / cm2 ve 300 ng / cm2) bağlı bir on kat bir fark elde etmek için, laminin-1 Bu iki tatbik konsantrasyonlarını kullanarak. </li><li> Laminar akış, bir asitle yıkanmış ve pişmiş c yerleştirmek için ince forseps kullanımıBir 35 mm kültür çanak dibine overslip. Gerekli yemekleri sayısını elde etmek için gerektiği kadar tekrarlayın. </li><li> Daha da sterilizasyon sağlamak üzere 20-30 dakika süre ile, UV ışığına maruz lamelleri. Bu aşama esnasında çanak kapağı kapalı tutunuz. </li><li> Her cam lamel hazırlanan laminin-1 400 ul ekleyin. Lamel tam kapsama sağlamak için laminin-1 yaymak için pipet kullanın. Yüzey gerilimi, laminin-1 lamel kalır ve gerektiğinde, kültür kabı, bir alt üzerine yayılmaz sağlayacaktır. </li><li> Tabağa kapağı yerleştirin ve laminin-1, oda sıcaklığında 2-3 saat süreyle inkübe izin (3 saat uygunudur). </li><li> Laminin-1 inkübasyondan sonra, laminar akış başlığı içinde steril PBS ile aseptik teknik kullanılarak lamelleri yıkayın. Lamel çözüm çıkarın ve PBS 400 ul ekleyin. 5-10 dakika bekleyin. 3 durulama toplam tekrarlayın. </li><li> Son durulama sonra lamel PBS bırakın. Durulama sırasında yüzey gerilimini kırmak etmeyin ve lamelleri kurumasına izin vermeyin. Lehazır olana kadar üzerinde ave kapak coverlip üzerine nöronlar ayrışmış plakasına. </li></ol> 5. Ayrılma, zenginleştirilip, ve Kültürleme DRG Nöronlar - Bölüm 2 <ol><li> İnkübasyondan sonra, yavaşça ayrışmış DRG hücreleri ihtiva eden 100 mm tabak için alt durulama için 10 ml&#39;lik steril bir pipet kullanın. Sonra yavaşça yaklaşık 1/3 yemeğin üzerine 7 ml sınırdışı ~ pipet yardımı ile F12HS10 7 ml çekin, 45 ° açı ~ de çanak tutun. Yavaşça nöronlar yerinden oynatıp 5x tekrarlayın. </li><li> Çanak döndürün ve yemeğin başka 1/3, başka bir altı durular için, prosedürü durulama tekrarlayın. Yemeğin 1/3 kalan tekrar işlemi tekrarlayın. Bu şekilde, yavaşça çıkarmak için nöronlar F12HS10 ile çanak tüm alt yıkayın. </li><li> Aynı pipet kullanarak, 15 konik tüp 100 mm çanak F12HS10 içeren nöronlar aktarın. Hücrelerin topakçık 200 g&#39;de 5-10 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Rahatsız pelet bırakarak F12HS10 çıkarın. Isıtıldı F12H + takviyeleri 2 ml yeniden süspanse pelet. </li><li&gt; hücre yoğunluğu belirlemek için Hemasitometre kullanın. </li><li> İstenen kaplama konsantrasyonu (20 ug / ml laminin-1 ile kaplanmış 8,16 lamelleri boyunca 1 ug / ml laminin-1 ve 40.000 hücre / ml &#39;si ile kaplanmış lamelleri için 120.000 hücre / ml) elde etmek üzere F12H + takviyeleri ile, gereken hücreleri seyreltin. </li><li> Laminin kaplı lamelleri PBS çıkarın ve hemen lamelleri üzerine hücrelerinin 400 ul yerleştirin. Dikkatle nemlendirilmiş, 37 ° C hücre kültürü inkübatör çanak aktarın. Nöronlar, laminin-1 yapışmasının sağlanması için 3 saat için en az 1 saat süreyle ve en inkübe izin verin. </li><li> , Steril koşullar altında, yavaşça F12H + takviyeleri 1.6 ml nöron içeren 35 mm&#39;lik kaplara sel. NOT: Bu zamanda, bir örtücü kısım üzerine gerilim kırılabilir alanlar. Nöronlar yeterince lamel laminin-1 yapıştırılır var. </li><li> Kuluçka ve gece inkübe hücreleri dönün. Ertesi gün immünsitokimya gibi deneyler yapın. </li></ol> 6. Benmmunocytochemistry <ol><li> İmmünositokimya önce, 37 ° C su banyosunda ılık bir sabitleyici çözeltisi (% 4 paraformaldehit,% 30 sukroz 2X PBS). NOT: hücreleri sabitleme önce, böyle netrin-1, Mn 2, sonik kirpi, semaforin ve efrin 16,29-31 gibi çeşitli reaktifler ile tedavi. </li><li> Yavaş yavaş kültürü çanak F12H + takviyeleri 2 ml 1 ml&#39;sini uzaklaştırın. Yavaşça ısıtılmış sabitleştirici çözeltisi 1 ml. 10-15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe izin verin. </li><li> Dikkatle sabitleştirici çözüm kaldırmak ve 2 ml PBS ekleyin. PBS uygulaması nedeniyle sabit hücrelerin olası yerinden oynatmamaya kaçınarak, yemeğin kenarına doğru çözümü uygulayın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 5 yıkama toplam PBS yıkama tekrarlayın. Hücreler immünositokimyada Herhangi bir adım sırasında kurumasına izin vermeyin. </li><li> PBS çıkarın. Bloke etme çözeltisi, 1 ml halinde (% 0.1 Triton-X, 1X PBS,% 5 normal keçi serumu). Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. Alternatif olarak, yüzey molekülleri leke, Çözüm 8 engelleme Triton-X kullanmayın. </li><li> Üreticinin tavsiyesine göre çözümü engelleme içine primer antikorları sulandırmak. NCAM karşı antikorlar için 500 ve β1 integrinleri 16 aktif: 1 kullanın. , Bloke çözeltisini çıkarın primer antikor çözeltisi 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Primer antikor çözüm çıkarın ve 1X PBS 2 ml ekleyin. Oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca inkübe edin. 4 PBS yıkama toplam tekrarlayın. Gerekirse yıkar, uzatılabilir. </li><li> İkincil antikor 1 sulandırmak: 1000 çözümü engelleme. , PBS çıkarın 1 mi ikincil antikor solüsyonu ilave edildi ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. NOT: İkincil antikorlar ışığa duyarlı bulunmaktadır. Bu noktadan sonra mümkün olduğu kadar karanlıkta çözüm ve hücreleri tutun. </li><li> Sekonder antikor çözüm çıkarın ve daha önce yapıldığı gibi, 1x PBS ile 5x durulayın. </li><li> Fluoromount arasında ~ 60-80 ul uygulayınBir mikroskop lamı üzerine G. Ince forseps kullanarak, yavaşça mikroskop lamı üzerine Fluoromount G içine çanak ve alt lamel üzerinden lamel kaldırın. Hava kabarcıkları kaçının. </li><li> Mağaza karanlıkta 4 ° C&#39;de yatay olarak kayar. 12-24 saat sonra, Fluormount G polimerize edecek ve kapak sıkıca mikroskop lamı eklenir. Bu polimerizasyon basamağından sonra hücreler Resim tamamlanır. </li></ol>

<ol>
	<li>Millet, L. J., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+a+century+of+neuron+culture:+from+the+hanging+drop+to+microfluidic+devices.">Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices.</a> The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).</li><li>Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+neuron+subtypes+have+unique+substratum+preference+and+receptor+expression+before+target+innervation.">Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).</li><li>Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+way+to+go?+Cytoskeletal+organization+and+polarized+transport+in+neurons.">Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons.</a> Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).</li><li>Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+in+dendritic+spines.">Microtubule dynamics in dendritic spines.</a> Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).</li><li>Snow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pioneering+studies+on+the+mechanisms+of+axonal+regeneration.">Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration.</a> Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).</li><li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures:+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies.">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).</li><li>Condic, M. L., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-induced+changes+in+integrin+expression+regulate+neuronal+adhesion+and+neurite+outgrowth.">Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth.</a> Nature. 389, 852-856 (1997).</li><li>Lemons, M. L., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+integrin+activation+and+intracellular+cAMP+cause+Rho+GTPase+dependent+growth+cone+collapse+on+laminin-1.">Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1.</a> Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).</li><li>Beller, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+sensory+neuron+growth+cone+and+filopodial+responses+to+structurally+diverse+aggrecan+variants,+in+vitro.">Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro.</a> Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).</li><li>Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+neurons+adapt+to+the+inhibitory+proteoglycan+aggrecan+by+increasing+integrin+expression.">Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).</li><li>Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+sensory+neurons+to+hyalectin+and+decorin+proteoglycans.">Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).</li><li>Guan, W., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Netrin-1,+Neogenin+and+cUNC-5H3+expression+during+chick+dorsal+root+ganglia+development.">Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development.</a> Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).</li><li>Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+influences+cell+number+and+the+distribution+of+neuronal+subtypes+in+dorsal+root+ganglia.">Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia.</a> Developmental biology. 314, 317-328 (2008).</li><li>Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+has+a+dual+effect+on+the+growth+of+retinal+ganglion+axons+depending+on+its+concentration.">Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).</li><li>Kolpak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+guidance+factor-induced+macropinocytosis+in+the+growth+cone+plays+a+critical+role+in+repulsive+axon+turning.">Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).</li><li>Lemons, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+and+cAMP+mediate+netrin-induced+growth+cone+collapse.">Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse.</a> Brain research. 1537, 46-58 (2013).</li><li>Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+proteoglycan+elevates+cytoplasmic+calcium+in+DRG+neurons.">Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons.</a> Developmental biology. 166, 87-100 (1994).</li><li>Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+behavior+in+the+presence+of+soluble+chondroitin+sulfate+proteoglycan+(CSPG),+compared+to+behavior+on+CSPG+bound+to+laminin+or+fibronectin.">Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin.</a> Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).</li><li>Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfated+proteoglycans+in+astroglial+barriers+inhibit+neurite+outgrowth+in+vitro.">Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro.</a> Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).</li><li>Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+outgrowth+on+a+step+gradient+of+chondroitin+sulfate+proteoglycan+(CS-PG).">Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG).</a> Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).</li><li>Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+system-derived+chondroitin+sulfate+proteoglycans+regulate+growth+cone+morphology+and+inhibit+neurite+outgrowth:+A+light,+epifluorescence,+and+electron+microscopy+study.">Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study.</a> Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).</li><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li><li>Firnhaber, C., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+feeding+RNAi+in+C.+elegans+and+its+use+in+a+screen+for+essential+genes+required+for+GABA+neuron+function.">Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function.</a> PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).</li><li>Hollyday, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+wing+innervation.+I.+Time+course+of+innervation+and+early+differentiation+of+the+peripheral+nerve+pattern.">Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).</li><li>Hollyday, M., Morgan-Carr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+wing+innervation.+II.+Morphology+of+motor+and+sensory+axons+and+their+growth+cones+during+early+development.">Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).</li><li>Honig, M. G., Kueter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+cell+adhesion+molecules+on+the+growth+cones+of+chick+cutaneous+and+muscle+sensory+neurons.">The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons.</a> Developmental biology. 167, 563-583 (1995).</li><li>Tosney, K. W., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+major+pathways+for+neurite+outgrowth+in+the+chick+hindlimb.">Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb.</a> Developmental biology. 109, 193-214 (1985).</li><li>Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+semaphorin+3A+signaling+pathways+interact+in+regulating+sensory+neuronal+growth+cone+motility.">Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).</li><li>Munoz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-A5+inhibits+growth+of+embryonic+sensory+neurons.">Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons.</a> Developmental biology. 283, 397-408 (2005).</li><li>Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+distal+axons+is+not+required+for+growth+cone+responses+to+guidance+cues.">Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).</li><li>Condic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neuronal+regeneration+induced+by+transgenic+integrin+expression.">Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression.</a> Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).</li><li>Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+supports+the+survival+of+developing+muscle+sensory+neurons+in+culture.">Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).</li><li>Toyofuku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FARP2+triggers+signals+for+Sema3A-mediated+axonal+repulsion.">FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).</li><li>Steinmetz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+enhancement+of+the+intrinsic+growth+capacity+of+sensory+neurons+combined+with+the+degradation+of+inhibitory+proteoglycans+allows+functional+regeneration+of+sensory+axons+through+the+dorsal+root+entry+zone+in+the+mammalian+spinal+cord.">Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada izole etmek için ayrıntılı protokoller sunmak ve kültür bir civciv embriyo duyusal nöronlar ayrışmış. Bu prosedür vitro 7,8,10,16 yılında güçlü büyüyen nöronların zenginleştirilmiş bir nüfusu oluşturur. Çok sayıda hücresel ve moleküler teknikler burada açıklanan İmmünositokimya, aşağıdakileri içeren, bu kültüre edilmiş nöronlarda, uygulanabilir. Bu protokol, yakın zamanda nicel olarak duyu büyüme konilerinin 8,16 olarak imüno-akt...

Nöronlar hissi, görme, motor hareketinin, öğrenme ve bellek dahil, çeşitli işlevler için gerekli bilgiyi taşır karmaşık hücrelerdir. Diğer hücre tiplerinden Benzersiz, nöronlar iletişim için gerekli nöral otoyolları oluşturmak için, kol-gibi süreçleri olarak adlandırılan aksonlar uzatmak. Büyüyen akson ucunda bulunan kalkınma uzmanlaşmış bölümlerinde sırasında, kendine uygun hedef akson yol dışı ipuçlarının bir konser gezinmek, büyüme konileri denir. Büyüme konisinin navigasyon altında yatan karmaşık moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmış değildir. Iyi bu mekanizmaları anlamak için, araştırmacılar tanımlanmış ve basitleştirilmiş vitro ortamda nöronların çalışma hücre kültürü modelleri kullandık. Nöronal farklılaşma 2, sitoskeletal dinamikleri, endositoz ve kaçakçılığı, dendrit: kültürü 1 okuyan nöronlar da dahil olmak üzere nöronal hücre biyolojisi anlayışımızda önemli ilerlemelere yol açmıştırdüzenleme 3,4, aksonal rejenerasyon 5, ve bu nöropatiler 6 gibi klinik durumlar. Buna ek olarak, kültürlü nöronlar İmmünositokimya, hücre yüzeyi ko-bağışıklık çökelti Western blot, transfeksiyon, RNAi, ve bu büyüme konisi motilite timelapse analizi de dahil olmak üzere canlı bir görüntüleme araştırma teknikleri geniş bir yüksek ölçüde uygundurlar. Bu nedenle, birincil kültür nöronları Nöronların hücre biyolojisi çok yönlerini açıklamak için güçlü bir yaklaşım. Hücre kültürü modeli çevresel koşullar ve değişkenler üzerinde ayrıntılı kontrol ile araştırmacılar sağlar. Örneğin, kaplama nöronlar (ve buna uygun olarak büyür) edildiği katmanlarından kolayca manipüle edilebilir. Burada, iki farklı katmanlarından, düşük laminin-1 konsantrasyonu ile bir ve laminin-1 konsantrasyonları doyurarak ile diğer üretmek için ayrıntılı talimatlar sağlar. Şaşırtıcı bir şekilde, aynı molekülün farklı konsantrasyonlarda istenmeyen etkilere sahip olabilirİç nöronların durumu yanı sıra hücre yüzeyi bileşime. Örneğin, integrinler, cAMP ve yüzey düzeyleri hücre içi düzeyleri, bu iki substrat üzerine kaplanır 7,8 nöronlarında önemli ölçüde farklıdır. Daha başka çalışmalarda, fibronektin ve kondroitin sülfat proteoglikan, etki hücre yüzey moleküllerinin ifade edilmesi ve nöronal motilite 7-11 de dahil olmak üzere, bu diğer molekülleri göstermiştir. Buna ek olarak, aynı zamanda, hücre zarı bileşim ve nöronal motilite 12-16 darbe ve kolay ve hassas bir hücre kültürü modeli olarak manipüle olabilir nörotrofin ve neurotropins gibi çözünebilir moleküllerdir. Burada, biz yöntemleri izole etmek ve kültür civciv embriyoları duyusal nöronlar ayrışmış açıklar. Bu prosedür, akson büyümesinin 5,7,8,10,11,16-21 içeren nörobiyolojisinde önemli gelişmelere yapmak için kullanılmıştır ve gangliyon hücreleri 22 izole etmek için tasarlandı bir prosedürden modifiye edilmiştir. VarBu yaklaşımın birçok avantajları. İlk olarak, civciv sırt kök ganglion (DRG) gelişimi birçok özellikleri iyi doğum, akson uzantısı için zaman çerçevesi de dahil olmak üzere karakterize edilir, ve protein ifadesi böylece in vitro deneylerde bilgilendirici inşa etmek için bir öğretici temel sağlayarak, 2,23-28 profiller. İkinci olarak, nöronal kültürler araştırıcı daha doğrudan ayrışan nöronlar ve nöronal olmayan hücreler her ikisini ihtiva eden (nöronlar ve nöronal-olmayan hücreleri içeren) Bozulmamış DRG eksplantları ve / veya karışık kültürlerinin kullanıldığı alternatif yaklaşımlara kıyasla nöronların çalışma sağlar ayrışmış. Üçüncü olarak, burada açıklanan prosedür, basit, ucuz ve lisans elverişlidir. Bu nedenle, bu teknik araştırma hem de eğitim amaçlı kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol küçük varyasyonlar DRG&#39;ler dışındaki kaynaklardan nöronların hızlı, yüksek verim arınma izin vermelidir. Örneğin, bu prosedür, ENR nöronal olarak temin etmek üzere modifiye edilebilirembriyonik önbeyinde omurilik gibi diğer dokulardan iched kültürler. İmmünositokimya, bu protokoller ayrışan nöronal kültürler için optimize edilmiştir ve burada ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Nöral hücre adhezyon molekülü (NCAM) ve β1 integrinler karşı iki İmmünositokimya için prosedür sağlanır. Bu imüno yöntemlerle üretilen veriler kültüre edilmiş nöronlarda 8,16 uzaysal ve model oluşturmanın çok molekül yoğunluğunu incelemek için kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Sterile small culture dishes (35 mm)</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Sterile large culture dishes (100 mm)</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Sterile large Petri dishes (100 mm)</td><td>VWR</td><td>89000-302</td><td></td></tr><tr><td>Glass Petri dish (100 mm)</td><td>VWR</td><td>D108962</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Standard forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>1100-12</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (22 x 22 mm)</td><td>Fisher</td><td>12 518 105K</td><td>0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy</td></tr><tr><td>Porcelin coverslip holder</td><td>Thomas scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham&#039;s F12 media</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>VW3204-1</td><td>use at 2 M, can be used twice before discarding</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution</td></tr><tr><td>Laminin-1</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>Add 72 &amp;micro;l of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>15 ml Conical tube</td><td>cell treat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF 10x</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14080</td><td>used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water</td></tr><tr><td>Ham&#039;s F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Gibco</td><td>10438</td><td>use in F12HS20 at 10%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomyocin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>use 5 ml in 500 ml of F12 media</td></tr><tr><td>NT3</td><td>Millipore</td><td>GF031</td><td>Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 &amp;deg;C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 &amp;deg;C non-defrosting freezer</td></tr><tr><td>NGF</td><td>RnD systems</td><td>256-GF</td><td>Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 &amp;deg;C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>aliquot under sterile conditions, store at -20 &amp;deg;C, use at final concentration of 200 mM in F12H media</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>aliquot under sterile conditions, store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Gibco</td><td>15260</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 &amp;deg;C), cell incubation chamber (humidified, 37 &amp;deg;C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Immunocytochemistry Reagents Table&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Life technologies</td><td>PCN500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Primary Antibody Table&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Antibody against NCAM</td><td>Millipore</td><td>AB5032</td><td>polyclonal</td></tr><tr><td>Antibody against activated &amp;beta;1 ingegrin</td><td>Millipore</td><td>MAB19294</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Secondary Antibody Table&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa 548</td><td>Life technologies</td><td>A11036</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of dissociated sensory neurons from chick embryos

Nöronlar duyusunda, motor hareket, öğrenme ve bellek dahil, çeşitli işlevler için gerekli bilgiyi taşır yönlü hücrelerdir. In vivo nöronlar okuyan nedeniyle karmaşıklığı, çeşitli ve dinamik ortamlarda ve teknik sınırlamalar zor olabilir. Bu nedenlerden dolayı, in vitro olarak nöronların okuyan nöronların karmaşık sırlarını çözmek için oldukça faydalı olabilir. Hücre kültürü modelleri arasında iyi tanımlanmış bir yapısı çevre koşulları ve değişkenler üzerinde detaylı bir kontrol sağlar. Burada, izole ayırmak ve civciv embriyolardan kültürü birincil nöronların nasıl açıklar. Bu teknik, hızlı, ucuz ve sağlam duyusal nöronlar büyüyen üretir. Prosedür, tutarlı bir şekilde yüksek nöronlar için zenginleştirilmiştir kültürleri üretmektedir ve çok az nöron olmayan hücreler (% 5&#39;ten az) sahiptir. İlköğretim nöronların bu nedenle ayrıntılı prosedürler iki Distin oluşturmak için, işlenmemiş cam veya doku kültürü plastik iyi uymayanct, nöronal kaplama için iyi tanımlanmış laminin ihtiva katmanlarından açıklanmaktadır. Kültürlü nöronlar eş-immunoprecipitation, canlı hücre tahayyül, RNAİ&#39;nin ve İmmünositokimya dahil olmak üzere birden hücresel ve moleküler teknikler, son derece elverişlidir. Bu kültürlü nöronlar çift İmmünositokimya için prosedürler optimize edilmiş ve burada tarif edilmiştir.

Burada açıklanan protokol kültürü için çok az (örneğin, &lt;5%) nöronal olmayan hücrelerin 7,8,10,16 ile ayrışan embriyonik duyu nöronlarının zenginleştirilmiş bir popülasyonu araştırmacılar sağlar. Sayısız DRG&#39;ler lumbosakral, torakal ve servikal bölgelerde elde edilebilir. Araştırmacının ihtiyaçlarına bağlı olarak, bu farklı anatomik bölgelerden DRG&#39;ler kolaylıkla izole edilebilir. Örneğin, Şekil 1 Şekil 1C ve 1D ve ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos at JoVE.com

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Hücre kültürü modelleri çevre koşulları üzerinde ayrıntılı kontrol sağlar ve böylece nöronal hücre biyolojisi sayısız yönlerini aydınlatmak için güçlü bir platform sağlar. Biz civciv embriyolardan duyusal nöronlar, izole ayırmak ve kültür bir, hızlı, ucuz ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Katmanlarından hazırlanması ve immunositokimya detayları da sağlanmıştır.

Civciv Embriyolar itibaren İzolasyon ve Disosiye Duyu Nöronlar Kültür

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

isolation-culture-dissociated-sensory-neurons-from-chick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K Görüntüleme.  Assumption College.  Hücre kültürü modelleri çevre koşulları üzerinde ayrıntılı kontrol sağlar ve böylece nöronal hücre biyolojisi sayısız yönlerini aydınlatmak için güçlü bir platform sağlar. Biz civciv embriyolardan duyusal nöronlar, izole ayırmak ve kültür bir, hızlı, ucuz ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Katmanlarından hazırlanması ve immunositokimya detayları da sağlanmıştır. 

Video: Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Diseksiyon ve Chick Statoacoustic Ganglion ve Kollajen Jeller Omurilik eksplantlar Kültür Neurite akıbet Tahliller

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Tavuk embriyo Omurilik Dilim Kültür Protokolü

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

Chick Ciliary Ganglion Nöronların İzolasyon ve Kültür

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...

Isolation of DRG Neurons and Coculture with Schwann Cell Precursors to Generate Schwann Cells

Source: Tsui, Y, et al. <a href="https://app.jove.com/v/55794">Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells as a Source for the Generation of Mature Schwann Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a procedure for isolating dorsal root ganglion (DRG) neurons from rat embryos and co-culturing them with Schwann cell precursors to generate mature Schwann cells. The isolated DRGs are processed to isolate neurons and glial cells. The isolated cells are cultured to purify the neurons, which are then co-cultured with Schwann cell-like cells (SCLCs) in a co-culture medium. Interaction with the DRG neurons leads to the maturation of SCLCs into Schwann cells.

DRG Nöronlarının İzolasyonu ve Schwann Hücreleri Oluşturmak için Schwann Hücre Öncüleri ile Kokültür

Generation of Fate-committed Schwann Cells via Coculture with DRG Neurons
1. Preparation of purified rat DRG neurons

	Autoclave all dissection tools ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Nöronal Kültür Teknikleri

Çoklu kültür ve Etkileşim Çalışmaları

Isolation of Cells from Sensory Ganglia

Source: Kaelberer, M. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53917">A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the isolation of cells from the sensory ganglia of mice. Ganglia are subjected to enzymatic digestion to dissolve the extracellular matrix. Single cells are then collected via filtering through a cell strainer followed by density gradient centrifugation for debris removal. Finally, washing and centrifugation are done to collect the isolated cells for future analysis.

Duyusal Gangliyonlardan Hücrelerin İzolasyonu

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#8217;s IRB guidelines.
1. Sensory Ganglia Dissociation

	...

Birincil Nöronal Kültür

Isolation and Culturing of Cells from Mouse Embryo Dorsolateral Telencephalons

Source: Landeira, B. S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56063">Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a protocol for isolating and culturing primary cerebral cortex cells from the dorsolateral telencephalon of mouse embryos.

Fare Embriyo Dorsolateral Telenefalonlarından Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Isolating Cranial Neural Folds From a Chick Embryo for a Neural Crest Cell Culture

Source: Jacques-Fricke, B. T., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63799">Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video illustrates a technique for isolating cranial neural folds from the midbrain region of chick embryos. It presents a detailed dissection process of the neural folds, their placement, and attachment on fibronectin-coated coverslips, followed by the observation of neural crest cell migration from the neural folds.

Nöral krest hücre kültürü için bir civciv embriyosundan kraniyal nöral kıvrımların izole edilmesi

Gelişmiş Nöron Modelleri

Isolating and Culturing Chick Embryonic Neurons on a Multi-Electrode Array

Source: Sanchez, K. R., et al., <a href="https://app.jove.com/v/56300">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp.(2018)
This video demonstrates a method to isolate neurons from the forebrain of an early-stage chick embryo and culture them on a microelectrode array to form a neuronal network.

Civciv Embriyolar itibaren İzolasyon ve Disosiye Duyu Nöronlar Kültür

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler