Wir möchten Alison Philbrook, Belinda Barbagallo und Michael Francis für aufschlussreiche Kommentare zu diesem Beitrag danken. Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde von einem R15 Area Award 1R15NS070172-01A1 zu MLL ausgezeichnet unterstützt.

1. Deckglas Zubereitung: Acid-Waschung und Backen <ol><li> Mindestens 2 Tage vor der Dissektion (Schritt 2), beginnen die folgenden Schritte zur Deck vorzubereiten. Führen Sie den Säurewaschschritt, um Öle und gründlich sauber Deckgläser zu entfernen. </li><li> Ladedeck Porzellan Halter, die vertikal positioniert Deck und verhindert, dass sie sich berühren. Tauchen Halter und Deckglas in der Histologie Behälter mit 2 M Salzsäure (HCl) gefüllt. Alternativ, wenn Porzellan Halter nicht verfügbar ist, zu verbreiten ~ 20 Deckgläser horizontal, um den Boden von 100 mm Glaspetrischale abdecken und tauchen Deckgläser in 2 M HCl. </li><li> Zeigen Glasgefäß (mit Deckgläsern in Säure getaucht) auf Wippe Tabelle in Abzug und lassen sanfte Schaukel für mindestens 5 Stunden bei Raumtemperatur. Alternativ Deckgläser Säurewäsche über Nacht unter den gleichen Bedingungen. </li><li> Waschen Deckgläser mit destilliertem H 2 O (dH 2 O) durch Über Porzellan Halter geladenenmit Deckgläsern von 2 M HCl auf einen sauberen Glasbehälter mit der Histologie dH 2 O gefüllt Alternativ dekantieren 2 M HCl aus Glaspetrischale mit Deckgläsern und füllen dH 2 O. </li><li> Waschen durch Dekantieren dH 2 O wieder und Nachfüllen Glasgefäß mit frischem dH 2 O. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 schnelle Wäschen. </li><li> Beginnen Sie längere Wasch Regime durch Rücksendung Glasgefäß (mit Deckgläsern und dH 2 O) auf Rocker. Ermöglichen leichtem Schütteln für 10-30 min bei Raumtemperatur. Dann dekantieren dH 2 O und fügen Sie frisches dH 2 O. Wiederholen von insgesamt mindestens zehn Wäschen. Alternativ weiterhin Waschen über Nacht. </li><li> Platzieren gewaschen Deckgläser in den Ofen auf 350 ° C vorgewärmt. Bei der Verwendung von Porzellanhalter, entfernen Halter aus dH 2 O gefüllten Glasbehälter und legen Sie dann Halter mit Deckgläsern direkt in den Ofen. Bei Verwendung einer Glaspetrischale, dekantieren dH 2 O und legen Sie die Glasschale mit Deckgläsern in die furnace. </li><li> Bake Deckgläser für mindestens fünf Stunden oder über Nacht bei 350 ° C aufweist. </li><li> Nach der vollständigen Back ist, entfernen Deckgläser aus Porzellan Halter mit feinen Pinzette und legen in sterile 100 mm Glaspetrischale. Deckgläser lassen, die ursprünglich nicht in der Porzellanhalter in der Glaspetrischale wurden. </li></ol> 2. Küken Dissection und Isolierung von DRGs <ol><li> Entfernen fruchtbar, inszeniert White Leghorn-Küken Ei aus Inkubator (bei 37 bis 38,5 ° C auf dem Schüttler gehalten). HINWEIS: Frühere Studien haben embryonalen Tag 7-10 für die Isolierung von DRGs 2,8,11-13,16 verwendet. </li><li> Ort Ausgewählter Ei in Laminarströmungshaube. Führen alle unten unter aseptischen Bedingungen in der Sterilbank mit sterilen Lösungen und Instrumente aufgeführten Verfahren. Pre-warmen alle Lösungen in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Knacken Ei und Ort Inhalt in einem Kunststoff 100 mm Petrischale. Verwenden Sie Standard-Pinzette Embryo zu einem anderen 100 mm Petrischale übertragen. </li><li&gt; Mit einer Pasteur Pipette erwärmt 1x PBS auf Petrischale, um Gewebe feucht zu halten. Enthaupten Embryo durch Kneifen Hals mit feinen Pinzette. Übertragen auf einen anderen Körper sauber 100 mm Petrischale. </li><li> Mit warmem F12HS10 (Ham-F12, 10 mM HEPES, 100 Einheiten / ml Penicillin, 0,1 mg / ml Streptomycin, das 10% fetales Rinderserum) mit Pasteur-Pipette austeilen, um Gewebe feucht zu halten. Verwenden Pinzette Embryo auf seiner dorsalen Seite (1A) zu positionieren. </li><li> Zeigen 100 mm Kunststoff-Petrischale mit embryonalem Gewebe auf ein Fernglas Binokular Stereo in Laminarströmungshaube. Verwenden feinen Pinzette, um eine vertikale Mittellinienschnitt vom Schwanz bis zum Hals durch Kneifen den Entwicklungs Dermis, das Herz, Lunge und andere Organe aussetzen zu machen. Alternativ können Sie eine Reihe von kleinen Tränen in die inneren Organe aus. </li><li> Vorsichtig mit 2 Sets von sterilen feinen Pinzette zu: a) begreifen, die Hals und b) erfassen die Aorta oder anderes Gewebe unmittelbar über dem Herzen und ziehen in Richtung des Schwanzes,Ausnehmen des Tieres. </li><li> Werden, warmes F12HS10 mit Pasteur-Pipette, um Gewebe. Verwenden einer Pinzette, um alle verbleibenden Herz-Kreislauf, Atemwege oder Verdauungsorgane entfernen, um die Entwicklung von Rippen, Wirbelsäule und DRGs (1B-1D) aus. </li><li> Unter dem Binokular, verwenden feinen Pinzette die Organe weiter zu entfernen und sammeln DRGs auf beiden Seiten der Lendenwirbelsäule, schlechter als die Rippen. Sammeln DRGs durch Zupfen intakt DRGs aus dem Embryo. Kneifen und durchtrennen die Wurzeln, die von der DRG in Richtung des Rückenmarks zu erreichen und das Greifen der Entwicklungs Nerv, der von der DRG in Richtung der Peripherie oder umgekehrt erreicht. </li><li> Zeigen intakt DRGs in eine 35 mm Kulturschale mit warmem F12HS10 gefüllt. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, wie die dorsale oder ventrale Wurzeln, die DRGs festgesetzt haben, von den intakten DRGs in 35 mm-Schale durch Kneifen mit feinen Pinzette. </li><li> Um DRGs überlegen Lendenbereich zu erhalten, entfernen Sie die ventrale Hälfte des Brustraums und Cervical Wirbelsäule. Dies wird durch einen Schnitt in der Entwicklungs Wirbelsäule senkrecht zur Achse der Wirbelsäule im oberen Halsbereich und einem anderen Schnitt im oberen Lendenwirbelbereich erfolgen. Dann stellen Schnitte parallel zum Rückenmark-Achse entlang der rechten und der linken Seite der Wirbelsäule. Heben Sie die ventrale Hälfte der Wirbelsäule aus dem Embryo, der das macht die Rückenmark (1E-1F) aussetzt. </li><li> Einen einfachen Zugang zu ermöglichen DRGs, entfernen Sie die Brust-und Halsmark durch Ergreifen des Rückenmarks mit einer feinen Pinzette. Verwenden Sie die Pinzette, um das Rückenmark aus der Wirbelsäule zu heben. Näherungsweise ist die thorakale Wirbelsäule in der Ebene der Rippen und der Halsbereich ist besser als die Rippen. </li><li> Sammeln intakten Brust-und Gebärmutterhalskrebs DRGs mit feinen Pinzette und legen Sie sie in den warmen F12HS10 mit anderen DRGs. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, das DRGs haften kann. </li><li> Spülen Innere eines neuen Glaspasteurpipette mit F12HS10 zu helfenDRGs verhindern das Anhaften von Wänden der Pipette. Verwenden gespült Pipette, um alle DRGs und F12HS10 von kleinen Petrischale in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen übertragen und sofort mit Schritt 3 fort. HINWEIS: Zusätzliche Embryonen können zerlegt werden um die Anzahl der DRGs zu erhöhen. DRGs sollte in F12HS10 bei 37 ° C, bis sie für Schritt 3 gehalten werden. </li></ol> 3. Dissoziation, Anreicherung und Züchtung DRG-Neuronen - Teil 1 <ol><li> Ort konischen Rohr mit intakten DRGs in Zentrifugen und sanft drehen (200 × g) für 2-3 min. Bestätigen Sie, dass DRGs haben den Boden des Röhrchens versenkt. Wenn nicht, drehen Sie es erneut. </li><li> Mit einer Pipette vorsichtig entfernen F12HS10, so dass DRG-Pellet ungestört. 2 ml 1x Calcium und Magnesium kostenlos (CMF) PBS, verdrängen das Pellet der DRGs. Spin wieder entfernen und CMF PBS während das DRG-Pellet intakt. Dieser Waschschritt wiederholt für insgesamt drei Waschungen fötalen Rinderserum in F12HS10, die mit Trypsin Verdauung im nächsten Schritt stören würde entfernen. </li><li> 2 ml Trypsin, erwärmt auf 15 ml-Röhrchen mit 2 ml PBS-CMF und DRGs. Das Röhrchen in 37 ° C Wasserbad für 10-15 min auf DRGs in dissoziierten Zellen zu verdauen. </li><li> Während der Inkubation machen F12H + Ergänzung mit Medium (Ham-F12, 10 mM HEPES 100 Einheiten / ml Penicillin, 0,1 mg / ml Streptomycin, 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml NGF, 200 mM L-Glutamin und N2) und Warm in 37 ° C Wasserbad. Typischerweise ist 10 ml Gesamt Medien reicht für 4-5 35 mm Gerichte der primären sensorischen Neuronen. Auch beginnen Auftauen Laminin-1 für die Beschichtung von Deckgläsern (Schritt 4). </li><li> Sanft verreiben DRGs in Trypsin-Lösung mit p1000 Pipette und einer Sichtprüfung auf Abwesenheit von intakten DRGs. Weiterhin intakt, bis Verreiben DRGs werden nicht mehr von Auge gesehen und / oder erlauben mehr Trypsin Inkubation in 37 ° C warmes Wasserbad, bis intakt DRGs dissoziiert sind. DRG-Neuronen vor Schäden zu schützen, vermeiden Sie Luftblasen beim Verreiben und Trypsin Verdauung auf &lt;30 min zu begrenzen. </li><li> Centrifuge Röhrchen mit dissoziiert DRGs und Trypsin bei 200 g für 3-5 min zu Pellets zu bilden. Mehr drehen, wenn nötig, bis Pellet gebildet. </li><li> Sorgfältig absaugen Trypsin ohne Unterbrechung Pellets. 2 ml F12HS10 zu pelletieren. Sanft verreiben DRGs mit einem P1000 Pipettenspitze. </li><li> Übertragen Sie alle Inhalte aus 15 ml konischen Röhrchen in 100 mm Kulturschale. Spülen des Röhrchens mit 8 ml F12HS10 und übertragen sie in die Kulturschale, 2 ml in einer Zeit von insgesamt 10 ml auf. Dieser Schritt hilft Spülen sammeln Zellen, blieb an den Wänden der Röhre eingehalten haben. </li><li> Platzieren 100 mm Kulturschale (10 ml F12HS10 und dissoziierten DRG Zellen) in einem befeuchteten Inkubator 37 ° C für 3 Stunden. HINWEIS: CO 2 nicht in den Inkubator erforderlich, da HEPES-Puffer pH Medien in Abwesenheit von CO 2. Während der Inkubation binden an Gliazellen Oberfläche der Gewebekulturkunststoff und Neuronen dazu neigen, lose an Gliazellen Bett einzuhalten. </li></ol> 4. Beschichtung Acid WashedGebackene und Deckgläser mit Laminin-1 <ol><li> Auftauen sterile Aliquots von gefrorenen Laminin-1 auf Eis. </li><li> Unter sterilen Bedingungen, 1 ml steriler PBS 1x 50 ul Aliquot von Laminin-1. </li><li> Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um einen Absorptionswert von Laminin-1 bei 280 nm zu erhalten. Verwenden Sie diesen Wert in der folgenden Gleichung, um die Konzentration von Laminin-1 zu bestimmen. </li></ol> ABS = 280 (Konzentration mg / ml) * (Extinktionskoeffizient von Protein) Der Extinktionskoeffizient für Laminin-1 ist 0,86. <ol start="4"><li> Unter sterilen Bedingungen verdünnter Laminin-1 mit 1X PBS, um die Konzentrationen von 1 mg / ml und 20 mg / ml zu erhalten. Mit diesen beiden Anwendungskonzentrationen von Laminin-1, um eine zehnfache Differenz der Laminin-1 an das Deckglas (30 ng / cm 2 und 300 ng / cm 2, bzw.) nach Inkubation 7,8,10 gebunden zu erzielen. </li><li> In einer Steril, feinen Pinzette verwenden, um eine Säure gewaschen und gebacken c legenoverslip in den Boden einer 35 mm Petrischale. Bei Bedarf wiederholen, um die Anzahl der Gerichte erforderlich zu erhalten. </li><li> Unterwerfen die Deckgläser mit UV-Licht für 20-30 min, um weiter sicherzustellen Sterilisation. Schalendeckel halten während dieser Schritt. </li><li> Fügen Sie 400 ul bereit Laminin-1 zu jedem Deckglas. Verwenden Pipettenspitze an Laminin-1 verteilt, um eine vollständige Abdeckung der Deckglas zu gewährleisten. Oberflächenspannung ermöglicht Laminin-1 auf Deckglas bleiben und nicht auf Boden der Kulturschale, die erforderlich ist, zu verbreiten. </li><li> Platzieren Deckelschale auf und lassen Laminin-1, für 2-3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert (3 h ist optimal). </li><li> Nach Laminin-1 Inkubation spülen Deckgläser unter aseptischen Bedingungen mit sterilem PBS in Laminarströmungshaube. Entfernen Lösung auf Deckglas und fügen Sie 400 ul PBS. Warten 5-10 min. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Spülgänge. </li><li> Verlassen PBS auf Deckglas nach der letzten Spülung. Nicht die Oberflächenspannung beim Spülen zu brechen und nicht zulassen Deck austrocknen. Leave Deckel auf, bis Sie sie auf den coverlip dissoziiert Neuronen Platte. </li></ol> 5. Dissoziation, Anreicherung und Züchtung DRG-Neuronen - Teil 2 <ol><li> Nach der Inkubation mit einem 10 ml sterile Pipette vorsichtig spülen Sie den Boden der Schale mit 100 mm dissoziiert DRG-Zellen. Halten Schale bei ~ 45 ° Winkel, ziehen ~ 7 ml mit Pipette F12HS10 Hilfe, dann sanft zu vertreiben 7 ml auf etwa ein Drittel der Schale. Wiederholen 5x, sanft verdrängen Neuronen. </li><li> Drehen Teller und wiederholen Spülvorgang, für weitere sechs Spülungen, auf einem anderen ein Drittel der Schale. Wiederholen Sie die Prozedur erneut Rest 3.1 von Gericht. Auf diese Weise sanft spülen Sie den gesamten Boden der Schale mit F12HS10 Neuronen zu entfernen. </li><li> Mit derselben Pipette F12HS10 enthält Neuronen aus 100-mm-Schale bis 15 konischen Rohr. Zentrifuge für 5-10 min bei 200 g Zellen zu pelletieren. </li><li> F12HS10 entfernen, so Pellet ungestört. Pellet mit 2 ml erwärmt F12H + Ergänzungsmittel. </li><li&gt; Mit einer Zählkammer die Zelldichte zu bestimmen. </li><li> Verdünnte Zellen nach Bedarf mit F12H + Ergänzungen gewünschten Beschichtungskonzentration (120.000 Zellen / ml für die Deckgläser mit 1 ug / ml Laminin-1 und 40.000 Zellen / ml für die Deckgläser mit 20 ug / ml Laminin-1 8,16 beschichtet ist) zu erhalten. </li><li> Entfernen PBS von Laminin beschichteten Deckgläschen und sofort setzen 400 ul Zellen auf Deckgläsern. Schüssel vorsichtig in einer feuchten, 37 ° C Zellkulturbrutschrank. Lassen Sie für mindestens 1 h und bis zu 3 Stunden inkubiert, damit Neuronen an Laminin-1 zu halten. </li><li> Unter sterilen Bedingungen vorsichtig schwemmen 35 mm Schalen mit Neuronen mit 1,6 ml F12H + Ergänzungsmittel. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt Oberflächenspannung auf Deckglas gebrochen werden kann. Neuronen angemessen auf Laminin-1 auf Deckglas geklebt. </li><li> Zurück Zellen Inkubator beimpft und über Nacht. Experimente durchführen, wie Immunzytochemie am folgenden Tag. </li></ol> 6. Ichmmunocytochemistry <ol><li> Vor Immunzytochemie, warm Fixierlösung (4% Paraformaldehyd, 30% Saccharose 2X PBS) in 37 ° C Wasserbad. HINWEIS: Vor der Befestigung Zellen, Behandlung mit verschiedenen Reagenzien, wie Netrin-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, semaphorin und Ephrin 16,29-31. </li><li> Entfernen Sie langsam 1 ml der 2 ml F12H + Ergänzungen aus Kulturschale. Vorsichtig 1 ml Fixierungslösung erwärmt. Lassen Sie bei Raumtemperatur für 10-15 min inkubiert. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Fixierungslösung und 2 ml PBS. Bewerben Lösung in Richtung Rand der Schale, die Vermeidung von möglichen Herauslösen fixierten Zellen aufgrund der Anwendung von PBS. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Wiederholen PBS waschen für insgesamt 5 Wäschen. Erlauben keine Zellen, die während jeder Schritt der Immunzytochemie trocknen. </li><li> PBS zu entfernen. Wenden Sie 1 ml Blocking-Lösung (0,1% Triton-X 1X PBS, 5% normalem Ziegenserum). Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. Alternativ zu Oberflächenmoleküle Fleck, Verwenden Triton-X in Blockierlösung 8 nicht. </li><li> Verdünnen primären Antikörper in Blockierungslösung pro Empfehlung Herstellers. Verwenden Sie 1: 500 für Antikörper gegen NCAM und aktiviert β1 Integrine 16. Entfernen Blockierlösung, 1 ml der primären Antikörperlösung und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen primären Antikörperlösung und 2 ml 1X PBS. Inkubation für 5-10 min bei Raumtemperatur. Wiederholen für insgesamt 4 Waschungen mit PBS. Waschungen kann verlängert werden, wenn nötig. </li><li> Verdünnen sekundären Antikörper 1: 1000 in Blockierlösung. Entfernen PBS, 1 ml Sekundärantikörperlösung und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. HINWEIS: Sekundärantikörper sind lichtempfindlich. Halten Sie Lösungen und Zellen in der Dunkelheit so viel wie möglich von diesem Punkt an. </li><li> Entfernen sekundären Antikörperlösung und spülen Sie 5x mit PBS 1x, wie bisher. </li><li> Gelten ~ 60-80 ul FluoromountG auf einen Objektträger. Mit feinen Pinzette vorsichtig anheben Deckglas von Gericht und unteren Deckglas in Fluoromount G auf Objektträger. Luftblasen vermeiden. </li><li> Laden horizontal gleitet bei 4 ° C im Dunkeln. Nach 12-24 h wird Fluormount G polymerisieren und Deckglas wird fest mit Mikroskop-Objektträger befestigt werden. Bildzellen nach diesem Polymerisationsschritt beendet ist. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li><li>Firnhaber, C., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+feeding+RNAi+in+C.+elegans+and+its+use+in+a+screen+for+essential+genes+required+for+GABA+neuron+function.">Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function.</a> PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).</li><li>Hollyday, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+wing+innervation.+I.+Time+course+of+innervation+and+early+differentiation+of+the+peripheral+nerve+pattern.">Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).</li><li>Hollyday, M., Morgan-Carr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+wing+innervation.+II.+Morphology+of+motor+and+sensory+axons+and+their+growth+cones+during+early+development.">Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).</li><li>Honig, M. G., Kueter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+cell+adhesion+molecules+on+the+growth+cones+of+chick+cutaneous+and+muscle+sensory+neurons.">The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons.</a> Developmental biology. 167, 563-583 (1995).</li><li>Tosney, K. W., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+major+pathways+for+neurite+outgrowth+in+the+chick+hindlimb.">Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb.</a> Developmental biology. 109, 193-214 (1985).</li><li>Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+semaphorin+3A+signaling+pathways+interact+in+regulating+sensory+neuronal+growth+cone+motility.">Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).</li><li>Munoz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-A5+inhibits+growth+of+embryonic+sensory+neurons.">Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons.</a> Developmental biology. 283, 397-408 (2005).</li><li>Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+distal+axons+is+not+required+for+growth+cone+responses+to+guidance+cues.">Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).</li><li>Condic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neuronal+regeneration+induced+by+transgenic+integrin+expression.">Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression.</a> Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).</li><li>Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+supports+the+survival+of+developing+muscle+sensory+neurons+in+culture.">Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).</li><li>Toyofuku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FARP2+triggers+signals+for+Sema3A-mediated+axonal+repulsion.">FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).</li><li>Steinmetz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+enhancement+of+the+intrinsic+growth+capacity+of+sensory+neurons+combined+with+the+degradation+of+inhibitory+proteoglycans+allows+functional+regeneration+of+sensory+axons+through+the+dorsal+root+entry+zone+in+the+mammalian+spinal+cord.">Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier präsentieren wir Ihnen ausführliche Protokolle zur Isolierung und Kultivierung dissoziiert sensorischen Neuronen aus einem Hühnerembryo. Dieses Verfahren erzeugt eine angereicherte Population der stark wachsenden Nervenzellen in vitro 7,8,10,16. Zahlreiche zelluläre und molekulare Techniken können auf diese Nervenzellen in Kultur, einschließlich Immunzytochemie, die hier beschrieben wird, angewendet werden. Dieses Protokoll wurde vor kurzem zur quantitativen Bewertung der Intensität der i...

Neuronen sind komplexe Zellen, die wesentlichen Informationen für eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich Sensation, Vision, Motorbewegung, Lernen und Gedächtnis zu tragen. Einzigartig von anderen Zelltypen, Neuronen erstrecken Arm-wie Prozesse, die so genannte Axone, um wesentliche neuronale Autobahnen für die Kommunikation zu bilden. Während der Entwicklung spezialisiert Fächer an den Spitzen der wachsenden Axone, dem sogenannten Wachstumskegel, navigieren durch ein Konzert der extrazelluläre Signale, die Axon seine entsprechenden Ziel führen. Die komplizierten molekularen Mechanismen, die Wachstumskegel Navigation zugrunde liegen, sind nicht vollständig verstanden. Um diese Mechanismen besser zu verstehen, haben Forscher Zellkulturmodelle verwendet werden, um Nervenzellen in einem definierten und vereinfacht in vitro-Umgebung zu studieren. Neuronalen Differenzierung 2, Zytoskelett-Dynamik, Endozytose und Menschenhandel, Dendriten: Studieren Neuronen in Kultur 1 hat zu erheblichen Fortschritte in unserem Verständnis der neuronalen Zellbiologie einschließlich geführtRegulation 3,4, axonale Regeneration 5 und klinischen Zuständen, wie Neuropathien 6. Außerdem sind kultivierten Neuronen sehr gut für einen weiten Bereich von Forschungstechniken einschließlich Immunzytochemie Zelloberfläche co-Immunpräzipitation, Western Blot, Transfektion, RNAi, und die Bildgebung wie Zeitraffer Analyse der Wachstumskegel Motilität. So Kultivierung primären Neuronen ist ein leistungsfähiges Konzept für zahlreiche Aspekte der Zellbiologie von Neuronen aufzuklären. Die Zellkultur-Modell bietet die Ermittler mit detaillierten Kontrolle über Umweltbedingungen und Variablen. Zum Beispiel kann der Substrate, auf denen Neuronen beschichtet (und wachsen auf) leicht manipuliert werden. Hier bieten wir detaillierte Anweisungen zur Erzeugung zwei unterschiedliche Substrate, eines mit einem niedrigen Laminin-1-Konzentration und das andere mit sättigenden Konzentrationen von Laminin-1. Überraschenderweise können unterschiedliche Konzentrationen des gleichen Moleküls dramatische Effekteauf dem internen Zustand der Neuronen sowie ihre Zelloberflächenzusammensetzung. Zum Beispiel sind intrazelluläre Niveaus von cAMP und der Oberflächenpegel der Integrine in Neuronen auf diesen beiden Substraten 7,8 plattiert signifikant unterschiedlich. Weitere Studien haben gezeigt, dass auch andere Moleküle, einschließlich Fibronektin und Chondroitinsulfatproteoglycane, Auswirkungen der Expression von Zelloberflächenmolekülen und neuronale Motilität 7-11. Weiterhin lassen sich lösliche Moleküle wie Neurotrophine und Neurotropine auch Auswirkungen Zellmembran Zusammensetzung und neuronalen Motilität 12-16 und kann in einem Zellkulturmodell leicht und genau bearbeitet werden. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Kultur dissoziiert sensorischen Neuronen von Hühnerembryonen. Dieses Verfahren wurde verwendet, um bedeutende Durchbrüche in der Neurobiologie, einschließlich Axon Auswuchs 5,7,8,10,11,16-21 machen und wurde von einem Verfahren entwickelt, um Ganglienzellen zu isolieren, 22 modifiziert. Es gibtmehrere Vorteile dieses Ansatzes. Zunächst werden viele Funktionen von Küken Hinterwurzelganglien (DRG) Entwicklung gut charakterisiert, einschließlich der Zeitrahmen für die Geburt, Axon Verlängerung und Proteinexpressionsprofile 2,23-28 und dadurch eine Grundlage, auf der lehr zu bauen informativ in-vitro-Experimenten. Zweitens, dissoziiert neuronalen Kulturen ermöglichen die Ermittler mehr direkt zu Nervenzellen zu untersuchen, verglichen mit alternativen Ansätzen mit intaktem DRG-Explantaten (die Neuronen und nicht-neuronalen Zellen enthalten) und / oder Mischkulturen, die sowohl dissoziierten Neuronen und nicht-neuronalen Zellen. Drittens ist das hier beschriebene Verfahren unkompliziert, kostengünstig und zugänglich für Studenten. Daher kann diese Technik für die Forschung als auch für Lehrzwecke verwendet werden. Außerdem sollten kleinere Variationen dieses Protokoll schnell, hohe Ausbeute Reinigung von Neuronen aus anderen Quellen als DRGs zu ermöglichen. Zum Beispiel könnte das Verfahren modifiziert, um neuronal bereitzustellen ENRiched Kulturen aus anderen Geweben, wie embryonalen Vorderhirns und des Rückenmarks. Immunzytochemie Protokolle für diese dissoziierten neuronalen Kulturen optimiert und werden im Detail hier beschrieben. Das Verfahren für die Doppel Immunzytochemie gegen neuronale Zelladhäsionsmolekül (NCAM) und β1 Integrine ist. Aus diesen immunzytochemische Methoden erzeugten Daten werden verwendet, um die räumliche Musterung und Intensität von mehreren Molekülen in kultivierten Neuronen 8,16 untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile small culture dishes (35mm)</td>
			<td style="width:176px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">430165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile large culture dishes (100mm)</td>
			<td style="width:176px;">Falcon</td>
			<td style="width:135px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile large petri dishes (100mm)</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">89000-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass petri dish (100mm)</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">D108962&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fine forceps</td>
			<td style="width:176px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">11251-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">standard forceps</td>
			<td style="width:176px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">1100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">coverslips&#160; (22x22)</td>
			<td style="width:176px;">Fisher</td>
			<td style="width:135px;">12 518 105K</td>
			<td>0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">porcelin coverslip holder</td>
			<td style="width:176px;">Thomas scientific</td>
			<td style="width:135px;">8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td>use 50ml aliquots per 500 mls of Ham&#39;s F12 media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCL</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">VW3204-1</td>
			<td>use at 2M, can be used twice before discarding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">S9888</td>
			<td>use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">laminin-1</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">23017-015</td>
			<td>Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml conical tube</td>
			<td style="width:176px;">cell treat</td>
			<td style="width:135px;">229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS CMF 10X</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">14200</td>
			<td>used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">14080</td>
			<td>used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ham&#39;s F12</td>
			<td style="width:176px;">Lonza</td>
			<td style="width:135px;">12-615F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">10438</td>
			<td>use in F12HS20 at 10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">H3375</td>
			<td>make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin streptomyocin</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P0781</td>
			<td>use 5mls in 500mls of F12 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NT3</td>
			<td style="width:176px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">GF031</td>
			<td>Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C&#160; non-defrosting freezer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td>&#160;aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,&#160; use 100ul per 10ml of F12H media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NGF</td>
			<td style="width:176px;">RnD systems</td>
			<td style="width:135px;">256-GF</td>
			<td>Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">l-glutamine</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G7513</td>
			<td>aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T4049</td>
			<td>aliquot under sterile conditions, store at -20 0C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">15260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">Other items needed:&#160; general dissection instruments, including&#160; glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37&#160; degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immunocytochemistry Reagents Table</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">S9378</td>
			<td>used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P6148</td>
			<td>used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluoromount G</td>
			<td style="width:176px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:135px;">0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">normal goat serum</td>
			<td style="width:176px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">PCN500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microscope slides</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">16004-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primary Antibody Table</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibody against NCAM</td>
			<td style="width:176px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">AB5032</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Antibody against activated beta 1 ingegrin</td>
			<td style="width:176px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MAB19294</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Seconday Antibody Table</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td style="width:176px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat anti-rabbit IgG Alexa 548</td>
			<td style="width:176px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of dissociated sensory neurons from chick embryos

Neuronen sind vielfältig Zellen, die wesentlichen Informationen für eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich Sensation, Motorbewegung, Lernen und Gedächtnis zu tragen. Studium Neuronen in vivo kann eine Herausforderung sein aufgrund ihrer Komplexität, ihrer abwechslungsreichen und dynamischen Umgebungen und technische Grenzen. Aus diesen Gründen, Studium Neuronen in vitro kann von Vorteil sein, um die komplexen Geheimnisse von Neuronen zu entwirren. Die gut definierte Art der Zellkulturmodellen bietet detaillierte Kontrolle über Umweltbedingungen und Variablen. Hier beschreiben wir, wie zu isolieren, zu distanzieren und Kultur primären Neuronen aus Hühnerembryonen. Diese Technik ist schnell, billig und erzeugt ein robustes Wachstum sensorischen Neuronen. Das Verfahren konsequent produziert Kulturen hoch Neuronen angereichert sind und nur sehr wenige nicht-neuronale Zellen (weniger als 5%). Primären Neuronen nicht gut an unbehandeltem Glas oder Kunststoffgewebekultur, daher detaillierte Verfahren zu zwei Distin erstellenCT, gut definierte Laminin enthaltenden Substraten für neuronale Plattierung beschrieben. Kultivierten Neuronen sind sehr gut für mehrere zelluläre und molekulare Techniken, einschließlich Co-Immunopräzipitation, Live Cell Vorstellung, RNAi, und Immunzytochemie. Verfahren für die Doppel Immunzytochemie auf diesen kultivierten Neuronen wurden optimiert und hier beschrieben.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht Ermittler Kultur eine angereicherte Population von dissoziierten embryonalen sensorischen Neuronen mit sehr wenigen (zB &lt;5%) nicht-neuronalen Zellen 7,8,10,16. Zahlreiche DRGs aus der lumbosakralen, des Brustraums und zervikalen Regionen erhalten werden. Je nach den Bedürfnissen des Forschers kann DRGs aus diesen unterschiedlichen anatomischen Regionen leicht isoliert werden. Zum Beispiel zeigt 1 Bilder des Hühnerembryos durch verschie...

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Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Zellkulturmodelle bieten detaillierte Kontrolle über Umweltbedingungen und damit eine leistungsfähige Plattform, um zahlreiche Aspekte neuronaler Zellbiologie aufzuklären. Wir beschreiben eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methode, um von Hühnerembryonen zu isolieren, zu dissoziieren, und die Kultur sensorischen Neuronen. Details der Substrate Vorbereitung und Immunzytochemie sind ebenfalls vorhanden.

Isolation und Kultur der Dissoziierte sensorischen Neuronen aus Hühnerembryonen

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K Aufrufe.  Assumption College.  Zellkulturmodelle bieten detaillierte Kontrolle über Umweltbedingungen und damit eine leistungsfähige Plattform, um zahlreiche Aspekte neuronaler Zellbiologie aufzuklären. Wir beschreiben eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methode, um von Hühnerembryonen zu isolieren, zu dissoziieren, und die Kultur sensorischen Neuronen. Details der Substrate Vorbereitung und Immunzytochemie sind ebenfalls vorhanden. 

Serie: Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned to completely random. In addition, fibers can be spun from a variety of materials, including biodegradable polymers such as poly-L-lactic acid (PLLA). These characteristics make electrospun fibers suitable for a variety of scaffolding applications in tissue engineering. Our focus is on the use of aligned electrospun fibers for nerve regeneration. We have previously shown that aligned electrospun PLLA fibers direct the outgrowth of both primary sensory and motor neurons in vitro. We maintain that the use of a primary cell culture system is essential when evaluating biomaterials to model real neurons found in vivo as closely as possible. Here, we describe techniques used in our laboratory to electrospin fibrous scaffolds and culture dorsal root ganglia explants, as well as dissociated sensory and motor neurons, on electrospun scaffolds. However, the electrospinning and/or culture techniques presented here are easily adapted for use in other applications.

Aligned electrospun fibers direct the growth of neurons in vitro and are a potential component of nerve regeneration scaffolds. We describe a procedure for preparing electrospun fiber substrates and the serum-free culture of primary rat E15 sensory (DRG) and motor neurons. Visualization of neurons by immunocytochemistry is also included.

The Culture of Primary Motor und sensorischen Neuronen in definierten Medien auf Elektrogesponnene Poly-L-Lactid Nanofiber Gerüste

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus-vermittelte Gen-Manipulation und Visualisierung von Riechzellen In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Produktion und Isolierung der Axone von Sinneszellen für Biochemische Analyse mit Porous Filter

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Entfernung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Muskelgewebe aus Larval Filets für Immunfluoreszenzanalyse von sensorischen Neuronen und epidermalen Zellen

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...