Name: isolation and culture of dissociated sensory neurons from chick embryos
Uploaded: 2014-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
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Gostaríamos de agradecer a Alison Philbrook, Belinda Barbagallo e Michael Francis para comentários perspicazes sobre este papel. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada por um prêmio AREA R15 1R15NS070172-01A1 atribuído a MLL.

1. Coverslip Preparação: lavagem ácida e Bake <ol><li> Pelo menos 2 dias antes da dissecção (passo 2), começam as seguintes etapas para preparar lamelas. Execute o passo de lavagem de ácido para remover óleos e lamelas completamente limpas. </li><li> Lamelas de carga em suporte de porcelana que posiciona verticalmente lamelas e impede que eles se toquem. Submergir titular e lamelas em recipiente de vidro cheio histologia com ácido clorídrico 2 M (HCl). Alternativamente, se o titular de porcelana não está disponível, espalhe ~ 20 lamelas horizontalmente para cobrir o fundo de 100 milímetros de vidro placa de Petri e submergir lamelas em HCl 2 M. </li><li> Coloque recipiente de vidro (com lamelas submersas em ácido) na tabela de balancim em hotte e permitir agitação suave durante pelo menos 5 horas à temperatura ambiente. Alternativamente, lavagem ácida lamelas durante a noite sob as mesmas condições. </li><li> Lavar as lamelas com H2O destilada (dH2O), transferindo o suporte carregado porcelanacom lamelas de HCl 2 M para um recipiente de vidro limpo histologia preenchido com dH2O Alternativamente, decantar M HCl 2 de vidro placa de Petri com lamelas e encha com dH 2 O. </li><li> Lave por decantação dH2O novamente e recarregar recipiente de vidro com dH fresco 2 O. Repetir para um total de três lavagens rápidas. </li><li> Comece já esquema de lavagem retornando recipiente de vidro (com lamelas e dH 2 O) na cadeira de balanço. Permitir a agitação suave durante 10-30 minutos à temperatura ambiente. Então, decantar dH2O e adicionar dH fresco 2 O. Repita o procedimento para um total de pelo menos dez lavagens. Como alternativa, continuar a lavar durante a noite. </li><li> Coloque lamelas foram lavadas em forno pré-aquecido a 350 ° C. Se utilizar o suporte de porcelana, remova o suporte de dH 2 recipiente de vidro O-preenchido e coloque titular com lamelas diretamente no forno. Se estiver usando uma placa de Petri de vidro, decantar dH2O e coloque o prato de vidro com lamelas na furnace. </li><li> Asse lamelas durante pelo menos cinco horas ou durante a noite a 350 ° C. </li><li> Após o cozimento estiver concluída, remova lamelas do suporte de porcelana com uma pinça fina e coloque em estéril 100 milímetros de vidro placa de Petri. Deixe lamelas que não foram originalmente colocados no suporte de porcelana no vidro placa de Petri. </li></ol> 2. Pintinho dissecção e isolamento da GDH <ol><li> Remover fértil, encenado White Leghorn pintcher da incubadora (realizada no 37-38,5 ° C com balanço suave). NOTA: estudos anteriores usaram dia embrionário 7-10 para isolamento de GDH 2,8,11-13,16. </li><li> Coloque ovo selecionado na capela de fluxo laminar. Realizar todos os procedimentos listados abaixo, sob condições assépticas na câmara de fluxo laminar, com soluções e instrumentos esterilizados. Pré-quentes todas as soluções em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Rachadura conteúdo dos ovos e coloque em um plástico 100 milímetros placa de Petri. Use uma pinça padrão para transferência de embriões para outra 100 milímetros placa de Petri. </li><li&gt; Com uma pipeta Pasteur, adicione aquecido 1x PBS a placa de Petri para manter o tecido molhado. Decapitar embrião apertando o pescoço com uma pinça fina. Transferir para outro corpo limpo 100 milímetros placa de Petri. </li><li> Adicionar F12HS10 quente (F12 de Ham, HEPES 10 mM, 100 unidades / ml de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina, 10% de soro fetal bovino) a repartir com pipeta de Pasteur a manter o tecido molhado. Use fórceps para posicionar embrião no seu lado dorsal (Figura 1A). </li><li> Coloque 100 milímetros de plástico placa de Petri contendo tecido embrionário em um microscópio binocular estereoscópica dissecação em capela de fluxo laminar. Use uma pinça fina para fazer uma incisão na linha vertical a partir da cauda para o pescoço, apertando a derme em desenvolvimento para expor o coração, pulmão e outros órgãos. Como alternativa, fazer uma série de pequenas lágrimas para expor os órgãos internos. </li><li> Suavemente utilizar dois conjuntos de pinça fina estéreis para: a) compreender o pescoço e b) compreender a aorta ou outro tecido imediatamente superior ao coração e ao puxar para a cauda,evisceração do animal. </li><li> Aplicar F12HS10 quente com pipeta Pasteur para o tecido. Use uma pinça para remover todos os restantes órgãos cardiovasculares, respiratórias ou digestivas para expor as costelas em desenvolvimento, coluna vertebral e GDH (Figuras 1B-1D). </li><li> Sob o microscópio de dissecação, use uma pinça fina para remover mais órgãos e recolher GDH ao longo de ambos os lados da coluna vertebral lombar, inferior das costelas. Colete GDHs arrancando GDHs intactas do embrião. Aperte e cortar as raízes que chegam do DRG para a medula espinhal e agarrando o nervo desenvolvimento que chega do DRG para a periferia, ou vice-versa. </li><li> Coloque GDHs intactas em uma placa de cultura 35 milímetros cheio de F12HS10 quente. Remova qualquer excesso de tecido, como a dorsal ou raízes ventrais que possam ter aderido a GDH, a partir dos GDH intactas em 35 milímetros prato de compressão com uma pinça fina. </li><li> Para obter GDHs superiores para a região lombar, retire a metade ventral do tórax e Cervicoluna vertebral cal. Isso é feito por meio de corte na coluna vertebral em desenvolvimento perpendicular ao eixo da medula espinal na região cervical superior e outro corte na região lombar superior. Em seguida, fazer os cortes paralelos ao eixo da medula espinal ao longo do lado esquerdo da coluna vertebral e da direita. Levante a metade ventral da coluna vertebral do embrião, o que expõe os expõe a medula espinhal (Figuras 1E-1F). </li><li> Para permitir o acesso fácil para os GDH, retire a medula espinhal torácica e cervical, segurando a medula espinhal com uma pinça fina. Utilizar as pinças para levantar a medula da coluna vertebral. Como aproximação, a medula espinal torácica é ao nível de costelas e a área do colo do útero é superior à das nervuras. </li><li> Colete torácica intacta e GDH cervical com uma pinça fina e colocá-los em F12HS10 quente com outros GDH. Retire o excesso de tecido que podem aderir a GDH. </li><li> Lavar interior de uma nova pipeta Pasteur de vidro com F12HS10 para ajudarevitar GDH de degola para paredes de pipeta. Use pipeta lavado para transferir todos os GDH e F12HS10 de pequena placa de Petri a uma estéril tubo de 15 ml e proceder de imediato para a etapa 3. NOTA: Adicionais embriões podem ser dissecados para aumentar o número de GDH. GDH deveria ser mantido na F12HS10 a 37 ° C até estar pronto para a etapa 3. </li></ol> 3. dissociação, enriquecendo, e Cultivo DRG Neurônios - Parte 1 <ol><li> Coloque o tubo cônico com GDHs intactas para centrífuga e girar suavemente (200 xg) por 2-3 min. Confirme que GDHs ter afundado ao fundo do tubo. Se não, girar novamente. </li><li> Com uma pipeta, remova cuidadosamente F12HS10, deixando DRG pellet imperturbável. Adicionam-se 2 ml de 1x de cálcio e magnésio livres (CMF) PBS, desalojando o sedimento de DRG. Girar novamente e retire CMF PBS, deixando a pelota DRG intacta. Repetir esta etapa de lavagem para um total de três lavagens para remover o soro fetal bovino em F12HS10, o que iria interferir com a digestão da tripsina na próxima etapa. </li><li> Adicionam-se 2 ml de tripsina aquecida ao tubo de 15 ml contendo 2 ml de PBS e CMF DRGs. Coloque o tubo de 37 ° C banho-maria durante 10-15 minutos para digerir GDH em células dissociadas. </li><li> Durante a incubação, fazer F12H + suplemento contendo meio (F12 de Ham, 10 mM de HEPES a 100 unidades / ml de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina, 10 ng / ml de NT3, 10 ng / mL de NGF, 200 mM de L-glutamina e N2) e aquecer em 37 ° C num banho de água. Tipicamente, 10 ml de meio total é suficiente para 4-5 pratos de 35 mm de neurónios sensoriais primários. Também começar o descongelamento da laminina-1 para lamelas de revestimento (passo 4). </li><li> GDH suavemente triturado em solução de tripsina com pipeta P1000 e inspecionar visualmente a ausência de GDH intactas. Continue trituração até GDHs intactas já não são vistos a olho nu e / ou permitir mais tempo de incubação de tripsina em 37 ° C banho-maria até GDHs intactas são dissociados. Para proteger os neurônios DRG de danos, evitar bolhas de ar durante a trituração e limitar digestão com tripsina a &lt;30 min. </li><li> Centrifugtubo e contendo GDHs dissociados e tripsina a 200 xg por 3-5 min para formar pelotas. Girar mais longo se necessário, até que se formou sedimento. </li><li> Aspirar cuidadosamente tripsina sem interromper pellet. Adicionar 2 ml de F12HS10 para sedimentar. Gentilmente triturar GDH com uma ponta de pipeta P1000. </li><li> Transferir todo o conteúdo do tubo de 15 ml em 100 milímetros placa de cultura. Lavar o tubo com 8 ml F12HS10 e transferi-lo para o prato de cultura, 2 ml de cada vez, para um total de 10 ml. Esta etapa de lavagem permite a recolha de células que podem ter permanecido adere às paredes do tubo. </li><li> Coloque 100 mm prato de cultura (com 10 ml F12HS10 e células dissociadas DRG) em atmosfera húmida a 37 ° C durante 3 horas incubadora. NOTA: CO 2, não é necessária na incubadora porque buffers HEPES pH do meio, na ausência de CO 2. Durante a incubação, as células gliais se ligam a superfície de cultura de tecidos de plástico e tendem a aderir neurónios frouxamente a cama da glia. </li></ol> 4 Ácido Coating LavadoLamelas e cozidas com laminina-1 <ol><li> Descongele alíquotas estéreis congelado laminina-1 no gelo. </li><li> Sob condições estéreis, adicionar 1 ml de PBS estéril 1x a alíquota de 50 ul da laminina-1. </li><li> Utilizar um espectrofotómetro para se obter um valor de absorção de laminina-1 a 280 nm. Utilizar este valor na seguinte equação para determinar a concentração de laminina-1. </li></ol> ABS 280 = (concentração mg / ml) * (coeficiente de extinção da proteína) O coeficiente de extinção para a laminina-1 é de 0,86. <ol start="4"><li> Sob condições de esterilidade, diluído laminina-1 com 1X PBS para se obter as concentrações de 1 mg / ml e 20 mg / ml. Usar estas duas concentrações aplicadas de laminina-1 para atingir uma diferença de dez vezes da laminina-1 ligado a lamela (30 ng / cm 2 e 300 ng / cm 2, respectivamente), após incubação 7,8,10. </li><li> Em uma capela de fluxo laminar, use uma pinça fina para colocar uma lavada com ácido e cozido coverslip no fundo de um prato de cultura de 35 mm. Repita conforme necessário para obter o número de pratos necessários. </li><li> Apresentar as lamelas a luz UV por 20-30 min para garantir ainda mais a esterilização. Manter tampa prato, durante este passo. </li><li> Adicionar 400 mL de preparadas laminina-1 para cada lamela de vidro. Use a ponta da pipeta para espalhar laminina-1 para garantir a cobertura completa da lamela. A tensão superficial vai permitir que a laminina-1 permaneça na lamela e não espalhada na parte inferior da placa de cultura, que é necessária. </li><li> Colocar a tampa no prato e permitir que a laminina-1 a incubar durante 2-3 horas à temperatura ambiente (3 horas é o ideal). </li><li> Depois de laminina-1 de incubação, lavar lamelas usando uma técnica asséptica com PBS estéril em capela de fluxo laminar. Remova a solução em lamela e adicionar 400 mL de PBS. Espere 5-10 min. Repita o procedimento para um total de 3 lavagens. </li><li> Deixe PBS em lamela após a última lavagem. Não quebrar a tensão superficial durante a lavagem e não permitem lamelas a secar. Letampa av em até estar pronto para a chapa neurônios dissociados na coverlip. </li></ol> 5. dissociação, enriquecendo, e Cultivo DRG Neurônios - Parte 2 <ol><li> Após a incubação, usar uma pipeta estéril 10 mL para lavar suavemente a parte inferior da placa de 100 mm contendo células DRG dissociados. Segure prato em ~ 45 ° de ângulo, puxe ~ 7 ml de F12HS10 com auxílio de pipeta, em seguida, expulsar gentilmente 7 ml para cerca de 1/3 do prato. Repita 5x, deslocando suavemente neurônios. </li><li> Rodar prato e repetir procedimento de lavagem, para outros seis lavagens, por outro 1/3 do prato. Repita o procedimento novamente para 1/3 restante do prato. Desta forma, lavar cuidadosamente toda a parte inferior do prato com F12HS10 para remover os neurónios. </li><li> Usando mesma pipeta, transferir F12HS10 contendo neurônios de prato de 100 mm a 15 tubo cônico. Centrifuga-se durante 5-10 minutos a 200 g para sedimentar as células. </li><li> Remover F12HS10, deixando sedimento imperturbável. Ressuspender o sedimento com 2 mL de F12H aquecida + suplementos. </li><li&gt; Use um hemocitômetro para determinar a densidade celular. </li><li> Dilui-se as células conforme necessário com F12H + suplementos para obter a concentração desejada chapeamento (120.000 células / ml para lamelas revestidas com 1 ug / ml de células de laminina-1 e 40000 / ml para lamelas revestidas com 20 ug / ml de laminina-1 8,16). </li><li> Remover PBS de lamelas revestido de laminina e coloque imediatamente 400 mL de células em lamelas. Transferir cuidadosamente prato para um umidificado, 37 ° C de cultura de células incubadora. Deixa-se incubar durante pelo menos 1 hora e até 3 horas para permitir que os neurónios para aderir à laminina-1. </li><li> Em condições estéreis, inundar suavemente 35 milímetros pratos contendo neurônios com 1,6 ml de F12H + suplementos. NOTA: Neste momento, a tensão superficial na lamela pode ser quebrado. Os neurônios têm suficientemente respeitado laminina-1 na lamela. </li><li> Voltar células para incubadora e incubar durante a noite. Realizar experimentos tais como imunocitoquímica no dia seguinte. </li></ol> 6.mmunocytochemistry <ol><li> Antes de imunocitoquímica, a solução fixadora quente (paraformaldeído a 4%, sacarose a 30% 2X PBS) em 37 ° C num banho de água. NOTA: Antes de fixar as células, trata-se com vários reagentes, como a netrina-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, semaforina, e efrina 16,29-31. </li><li> Lentamente remover 1 ml dos 2 ml de F12H + suplementos do prato de cultura. Suavemente adicionar 1 ml de solução fixadora aquecido. Deixa-se incubar à temperatura ambiente durante 10-15 min. </li><li> Remova cuidadosamente a solução fixadora e adicionar 2 ml de PBS. Aplicar a solução para a borda do prato, evitando possível desalojamento de células fixas devido à aplicação de PBS. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Repetir lavagem com PBS para um total de cinco lavagens. Não permitir que as células secar durante qualquer passo de imunocitoquímica. </li><li> Remover PBS. Aplicar 1 ml de solução de bloqueio (0,1% de Triton-X, 1X PBS, 5% de soro normal de cabra). Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Alternativamente, para corar as moléculas de superfície, Não use Triton-X em solução 8 bloqueio. </li><li> Dilui-se os anticorpos primários em solução de acordo com a recomendação do fabricante bloqueio. Use 1: 500 para anticorpos contra NCAM e ativado β1 integrinas 16. Retirar solução de bloqueio, adicionar 1 ml de uma solução de anticorpo primário e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remover solução de anticorpo primário e adicionar 2 ml de 1X PBS. Incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente. Repetir para um total de 4 lavagens com PBS. Lavagens pode ser prorrogado, se necessário. </li><li> Dilui-se o anticorpo secundário de 1: 1000 em solução de bloqueio. Remover PBS, adicionar 1 ml de solução de anticorpo secundário e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. NOTA: anticorpos secundários são sensíveis à luz. Manter as soluções e células no escuro, tanto quanto possível a partir deste ponto em diante. </li><li> Remova a solução anticorpo secundário e enxaguar 5x com 1x PBS, como feito anteriormente. </li><li> Aplicar ~ 60-80 ul de FluoromountG sobre uma lâmina de microscópio. Usando uma pinça fina, levante suavemente lamela de prato e menor lamela em Fluoromount G em lâmina de microscópio. Evite bolhas de ar. </li><li> Loja desliza horizontalmente, a 4 ° C no escuro. Após 12-24 horas, Fluormount G polimerizará e lamela será firmemente ligado a lâmina de microscópio. Células imagem após esta etapa de polimerização está completa. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li><li>Firnhaber, C., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+feeding+RNAi+in+C.+elegans+and+its+use+in+a+screen+for+essential+genes+required+for+GABA+neuron+function.">Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function.</a> PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).</li><li>Hollyday, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+wing+innervation.+I.+Time+course+of+innervation+and+early+differentiation+of+the+peripheral+nerve+pattern.">Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).</li><li>Hollyday, M., Morgan-Carr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+wing+innervation.+II.+Morphology+of+motor+and+sensory+axons+and+their+growth+cones+during+early+development.">Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).</li><li>Honig, M. G., Kueter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+cell+adhesion+molecules+on+the+growth+cones+of+chick+cutaneous+and+muscle+sensory+neurons.">The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons.</a> Developmental biology. 167, 563-583 (1995).</li><li>Tosney, K. W., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+major+pathways+for+neurite+outgrowth+in+the+chick+hindlimb.">Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb.</a> Developmental biology. 109, 193-214 (1985).</li><li>Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+semaphorin+3A+signaling+pathways+interact+in+regulating+sensory+neuronal+growth+cone+motility.">Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).</li><li>Munoz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-A5+inhibits+growth+of+embryonic+sensory+neurons.">Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons.</a> Developmental biology. 283, 397-408 (2005).</li><li>Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+distal+axons+is+not+required+for+growth+cone+responses+to+guidance+cues.">Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).</li><li>Condic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neuronal+regeneration+induced+by+transgenic+integrin+expression.">Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression.</a> Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).</li><li>Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+supports+the+survival+of+developing+muscle+sensory+neurons+in+culture.">Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).</li><li>Toyofuku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FARP2+triggers+signals+for+Sema3A-mediated+axonal+repulsion.">FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).</li><li>Steinmetz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+enhancement+of+the+intrinsic+growth+capacity+of+sensory+neurons+combined+with+the+degradation+of+inhibitory+proteoglycans+allows+functional+regeneration+of+sensory+axons+through+the+dorsal+root+entry+zone+in+the+mammalian+spinal+cord.">Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui apresentamos protocolos detalhados para isolar e cultura dissociada neurônios sensoriais de um embrião de galinha. Este procedimento gera uma população enriquecida de neurónios em crescimento in vitro de forma robusta 7,8,10,16. Numerosas técnicas celulares e moleculares podem ser aplicados a essas culturas de neurónios, incluindo a imunocitoquímica, o qual é descrito aqui. Este protocolo foi recentemente utilizado para avaliar quantitativamente a intensidade das integrinas ativados imu...

Os neurônios são células complexas que levam informações essenciais para uma variedade de funções, incluindo a sensação, visão, movimento motor, aprendizagem e memória. Único a partir de outros tipos de células, os neurônios estender os processos de braço-like, chamadas axônios, para formar rodovias neurais essenciais para a comunicação. Durante o desenvolvimento especializada compartimentos localizados na ponta dos axônios em crescimento, chamados cones de crescimento, navegar através de um concerto de sinais extracelulares para liderar o axônio para o seu destino apropriado. Os mecanismos moleculares que estão na base intrincadas do cone de crescimento de navegação não são completamente compreendidos. Para entender melhor esses mecanismos, os pesquisadores usaram modelos de cultura de células para estudar neurônios em um ambiente vitro definido e simplificado. Estudar neurônios em cultura 1 levou a avanços significativos em nossa compreensão da biologia de células neuronais, incluindo: a diferenciação neuronal 2, a dinâmica do citoesqueleto, endocitose e tráfico, dendritoregulação 3,4, a regeneração axonal 5, e as condições clínicas, tais como neuropatias 6. Além disso, os neurónios em cultura são altamente susceptível a uma vasta gama de técnicas de pesquisa, incluindo a imunocitoquímica, de células da superfície de co-imunoprecipitação, transferência Western, transfecção, ARNi, e imagens em tempo real, tais como análise de Timelapse cone de crescimento motilidade. Assim, a cultura de neurônios primários é uma abordagem poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular dos neurônios. O modelo de cultura celular fornece investigadores com controle detalhado sobre as condições ambientais e variáveis. Por exemplo, o substrato sobre o qual os neurónios foram semeadas (e crescer em cima) pode ser facilmente manipulado. Aqui, nós fornecemos instruções detalhadas para a geração de dois substratos distintos, um com uma baixa concentração de laminina-1 e outro com concentrações de saturação de laminina-1. Surpreendentemente, concentrações diferentes da mesma molécula pode ter efeitos dramáticossobre o estado interno de neurónios, bem como a sua composição da superfície da célula. Por exemplo, os níveis intracelulares de cAMP e níveis de superfície de integrinas são significativamente diferentes nos neurónios plaqueados sobre estes dois substratos 7,8. Outros estudos têm mostrado que outras moléculas, incluindo fibronectina e proteoglicanos de sulfato de condroitina, o impacto da expressão de moléculas da superfície celular e a motilidade neuronal 7-11. Além disso, as moléculas solúveis, tais como neurotrofinas e neurotropins também afectar a composição da membrana celular e a motilidade neuronal e 12-16 podem ser facilmente e com precisão manipulado em um modelo de cultura de células. Aqui, descrevemos os métodos para isolar e cultura dissociada neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Este procedimento tem sido usado para fazer avanços significativos em neurobiologia, incluindo axônio conseqüência 5,7,8,10,11,16-21 e foi modificado a partir de um procedimento destinado a isolar as células ganglionares 22. Temvárias vantagens para esta abordagem. Em primeiro lugar, muitas características da garota gânglio da raiz dorsal (DRG) desenvolvimento estão bem caracterizados, incluindo o período de tempo para o parto, a extensão do axônio, e expressão da proteína perfis 2,23-28, proporcionando assim uma base instrutiva sobre a qual construir informativo experimentos in vitro. Em segundo lugar, dissociado culturas neuronais permitem ao investigador para estudar mais directa em comparação com os neurónios de abordagens alternativas que utilizam explantes DRG intactos (que contêm neurónios e células não neuronais) e / ou culturas mistas que contêm ambos os neurónios dissociados e células não-neuronais. Em terceiro lugar, o procedimento descrito aqui é simples, barato e passível de graduação. Portanto, essa técnica pode ser usada para pesquisa, bem como para fins de ensino. Além disso, pequenas variações deste protocolo deve permitir a purificação rápida, alto rendimento de neurônios a partir de outras fontes de GDH. Por exemplo, este procedimento pode ser modificado para proporcionar neuronalmente enriched culturas de outros tecidos, tais como prosencéfalo embrionário ou da medula espinal. Imunocitoquímica protocolos foram optimizados para estas culturas neuronais dissociadas e são descritos em detalhe aqui. O procedimento para a imunocitoquímica dupla contra molécula de adesão de células neurais (NCAM) e integrinas β1 é fornecido. Os dados gerados a partir destes métodos imunocitoquímicos foram utilizados para examinar o padrão espacial e intensidade de várias moléculas em neurónios cultivados 8,16.

<table><tbody><tr><td>Sterile small culture dishes (35 mm)</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Sterile large culture dishes (100 mm)</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Sterile large Petri dishes (100 mm)</td><td>VWR</td><td>89000-302</td><td></td></tr><tr><td>Glass Petri dish (100 mm)</td><td>VWR</td><td>D108962</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Standard forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>1100-12</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (22 x 22 mm)</td><td>Fisher</td><td>12 518 105K</td><td>0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy</td></tr><tr><td>Porcelin coverslip holder</td><td>Thomas scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham&#039;s F12 media</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>VW3204-1</td><td>use at 2 M, can be used twice before discarding</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution</td></tr><tr><td>Laminin-1</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>Add 72 &amp;micro;l of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>15 ml Conical tube</td><td>cell treat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF 10x</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14080</td><td>used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water</td></tr><tr><td>Ham&#039;s F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Gibco</td><td>10438</td><td>use in F12HS20 at 10%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomyocin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>use 5 ml in 500 ml of F12 media</td></tr><tr><td>NT3</td><td>Millipore</td><td>GF031</td><td>Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 &amp;deg;C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 &amp;deg;C non-defrosting freezer</td></tr><tr><td>NGF</td><td>RnD systems</td><td>256-GF</td><td>Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 &amp;deg;C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>aliquot under sterile conditions, store at -20 &amp;deg;C, use at final concentration of 200 mM in F12H media</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>aliquot under sterile conditions, store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Gibco</td><td>15260</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 &amp;deg;C), cell incubation chamber (humidified, 37 &amp;deg;C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Immunocytochemistry Reagents Table&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Life technologies</td><td>PCN500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Primary Antibody Table&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Antibody against NCAM</td><td>Millipore</td><td>AB5032</td><td>polyclonal</td></tr><tr><td>Antibody against activated &amp;beta;1 ingegrin</td><td>Millipore</td><td>MAB19294</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Secondary Antibody Table&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa 548</td><td>Life technologies</td><td>A11036</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of dissociated sensory neurons from chick embryos

Os neurônios são as células multifacetadas que carregam informações essenciais para uma variedade de funções, incluindo a sensação, movimento motor, aprendizagem e memória. Estudar neurônios in vivo pode ser um desafio, devido à sua complexidade, seus ambientes variados e dinâmicos, e as limitações técnicas. Por estas razões, estudando neurônios in vitro pode ser benéfico para desvendar os mistérios complexos de neurônios. A natureza bem definida de modelos de cultura celular fornece controle detalhado sobre as condições ambientais e variáveis. Aqui nós descrevemos como isolar, dissociar, e neurônios cultura primária de embriões de galinha. Esta técnica é rápida, barata, robusta e gera crescente neurónios sensoriais. O procedimento produz consistentemente culturas que estão altamente enriquecidas em neurónios e tem muito poucas células não neuronais (menos do que 5%). Neurônios primários não adere bem ao vidro não tratada ou de cultura de tecidos de plástico, portanto, os procedimentos detalhados para criar dois disct, substratos contendo laminina bem definida para o chapeamento neuronais são descritos. Neurônios cultivados são altamente suscetíveis a várias técnicas celulares e moleculares, incluindo a co-imunoprecipitação, imaginação de células vivas, RNAi, e imunocitoquímica. Procedimentos para imunocitoquímica duas vezes nesses neurônios cultivados foram otimizados e descrito aqui.

O protocolo aqui descrito permite que os investigadores a cultura de uma população enriquecida de neurónios sensoriais dissociados de embriões com muito poucas células (por exemplo, &lt;5%) não neuronais 7,8,10,16. Numerosos GDHs pode ser obtido a partir da região cervical lombossacral, torácicas e. Dependendo das necessidades do investigador, DRGs destas regiões anatómicas distintas pode ser facilmente isolado. Por exemplo, a Figura 1 mostra imagens do embrião de galinha ...

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Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Modelos de cultura celular proporcionar um controle detalhado sobre as condições ambientais e, assim, proporcionar uma plataforma poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular neuronal. Nós descrevemos um método rápido, barato e confiável para isolar, dissociar e cultura neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Os detalhes da preparação substratos e imunocitoquímica também são fornecidos.

Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K visualizações.  Assumption College.  Modelos de cultura celular proporcionar um controle detalhado sobre as condições ambientais e, assim, proporcionar uma plataforma poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular neuronal. Nós descrevemos um método rápido, barato e confiável para isolar, dissociar e cultura neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Os detalhes da preparação substratos e imunocitoquímica também são fornecidos. 

Vídeo: Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Dissecção e Cultura do Gânglio pintainho Statoacoustic e Explantes da Medula Espinhal em géis de colágeno para Ensaios crescimento de neuritos

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Neurociência

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Isolamento e cultivo de células neurais embrionárias de ratos: um protocolo rápido

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Embrião de galinha Spinal Cord Protocolo Cultura Slice

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento de neurônios sensoriais de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Para Remendo Recordings Grampo de Correntes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

Isolamento e Cultura de Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...

Isolation of DRG Neurons and Coculture with Schwann Cell Precursors to Generate Schwann Cells

Source: Tsui, Y, et al. <a href="https://app.jove.com/v/55794">Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells as a Source for the Generation of Mature Schwann Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a procedure for isolating dorsal root ganglion (DRG) neurons from rat embryos and co-culturing them with Schwann cell precursors to generate mature Schwann cells. The isolated DRGs are processed to isolate neurons and glial cells. The isolated cells are cultured to purify the neurons, which are then co-cultured with Schwann cell-like cells (SCLCs) in a co-culture medium. Interaction with the DRG neurons leads to the maturation of SCLCs into Schwann cells.

Isolamento de neurônios DRG e cocultura com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann

Generation of Fate-committed Schwann Cells via Coculture with DRG Neurons
1. Preparation of purified rat DRG neurons

	Autoclave all dissection tools ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Co-culture and Interaction Studies

Isolation of Cells from Sensory Ganglia

Source: Kaelberer, M. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53917">A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the isolation of cells from the sensory ganglia of mice. Ganglia are subjected to enzymatic digestion to dissolve the extracellular matrix. Single cells are then collected via filtering through a cell strainer followed by density gradient centrifugation for debris removal. Finally, washing and centrifugation are done to collect the isolated cells for future analysis.

Isolamento de células de gânglios sensoriais

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#8217;s IRB guidelines.
1. Sensory Ganglia Dissociation

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Primary Neuronal Culture

Isolation and Culturing of Cells from Mouse Embryo Dorsolateral Telencephalons

Source: Landeira, B. S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56063">Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a protocol for isolating and culturing primary cerebral cortex cells from the dorsolateral telencephalon of mouse embryos.

Isolamento e Cultura de Células de Telencéfalos Dorsolaterais de Embriões de Camundongos

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Isolating Cranial Neural Folds From a Chick Embryo for a Neural Crest Cell Culture

Source: Jacques-Fricke, B. T., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63799">Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video illustrates a technique for isolating cranial neural folds from the midbrain region of chick embryos. It presents a detailed dissection process of the neural folds, their placement, and attachment on fibronectin-coated coverslips, followed by the observation of neural crest cell migration from the neural folds.

Isolando dobras neurais cranianas de um embrião de pintinho para uma cultura de células da crista neural

Advanced Neuronal Models

Isolating and Culturing Chick Embryonic Neurons on a Multi-Electrode Array

Source: Sanchez, K. R., et al., <a href="https://app.jove.com/v/56300">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp.(2018)
This video demonstrates a method to isolate neurons from the forebrain of an early-stage chick embryo and culture them on a microelectrode array to form a neuronal network.

Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Resumo

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