博士はキーティングは、DODのグラントCA100335によって資金を供給し、聖剣帯の財団奨学生です。

すべての記載された手順を見直し、当社の制度的動物管理使用委員会によって承認された。 1実験を計画<ol><li>噴射すべきセルを選択してください。接着細胞培養株、遺伝的に改変されたクローン、神経前駆細胞、初代培養、または脱凝集性腫瘍：さまざまなソースからの細胞を注入するための候補である。希望モデルの​​タイプは、注射の最も適切なサイトを定義します。 <ol><li>注射のための細胞数を決定します。腫瘍を形成するのに必要な細胞数は、細胞株に応じて変化し、経験的に決定されなければならない。腫瘍増殖速度は、細胞型、細胞数および組織培養継代回数に大きく依存する。 1×10 4〜2×10 5以上の注射ごとに複数に及ぶ細胞数を変化させ、成長率の腫瘍を作り出した。 </li><li>注射のためのボリュームを制限します。細胞は、無血清培地またはリン酸緩衝sの最小の容積に懸濁されるべきである26 G針を滑らかで、容易な通過を可能にアリーン（PBS）が挙げられる。小さい体積は、実際に、脳内に送達より正確で得られた腫瘍を定義し;最適な結果は、3〜6μlの範囲の容積を注入することによって得られる。混合サンプリング、正確な測定を可能にするために関係なく、計画された注入回数を、懸濁した細胞の少なくとも50μlの最終全体積を準備することを計画。 </li></ol></li><li>モデルに適したマウスを選択してください。ヒト腫瘍のマウスモデルは、典型的には、免疫媒介性移植片拒絶を回避するために、若い免疫不全マウスを利用する。適切な予防措置が除染、消毒、および資機材の殺菌を含め、取得された場合、作業は生物学的安全キャビネットの中で場所を取る必要はありません。ここに示されている作業は、生後6〜12週の間、雄と雌の無胸腺ヌードマウスで行われている。 20g未満の重量を量るマウスは、として位置決めすることが困難な場合がtereotaxicフレームおよび低体温の影響をより受けやすいかもしれません。 </li></ol> 2機器を組み立て<ol><li>入手し、マウスを定位フレーム、アライメントコンソール、およびマウスガス麻酔ヘッドホルダー、マイクロシリンジポンプ、熱パッド、麻酔器、光ファイバ作業ランプ、可変速度回転ドリルを除染。清掃し、すべての機器を除染。 </li><li>シリンジポンプの動作に必要な他の変数（注入容量、流量、速度単位、注射器型を含む）プログラム注入パラメータ。各特定のモデルの設定を最適化します。 注：これらの注射での設定は（デバイスタイプ「E」）25μlの注射器を用いて400 NL /分の速度（レートの単位「M」）で3000 NLサンプルであった非グループ化（「N」）モードで。 </li><li>最後の里をやって、滅菌脱イオン水を数回のすすぎで26 G針で精密マイクロシリンジ（のdiH 2 O）および70％エタノール（エタノール）を清掃してくださいのdiH 2 OでNSE一部を除くすべてのモデルは、オートクレーブ処理するように設計されていません。プランジ​​ャーの動きが滑らかで、自由であることを確認してください。 </li><li>麻酔引き渡し装備を入手します。それは、麻酔の深さと持続時間を調節することが容易であるイソフルランは、好ましい麻酔薬である。定位ユニットは、マウスの麻酔ガスアタッチメントで、必要なチューブとコネクタは、マウスに麻酔器からガス混合物を提供するために用意されていることを装備していることを確認します。 </li><li>細い先端（歯）はさみ、ピンセット2 /止血、縫合のために、中規模のはさみ、中·先の細いピンセット、および少なくとも2つの1ミリメートル歯科用ドリルビットを含むオートクレーブ手術器具、。 70％エタノール、消毒剤、またはビーズ滅菌器で手術中にきれいな楽器にしてください。 </li><li> （所望の場合）から、イソフルラン、鎮痛剤、眼軟膏剤/潤滑剤、抗生物質軟膏、生理食塩水、30％過酸化水素（H 2 O 2）、防腐剤、および骨ろうを得る獣医や医療の供給。無菌のdiH 2 Oおよび70％エタノールを調製します。そのようなガーゼパッド、無菌包帯、縫合糸、エタノール綿棒、コットン先端スワブ、無菌手術用手袋、手術用ブレードなど多くの使い捨ては、材料リストに項目ごとに表示されます。頭蓋骨をマークする先端の細い油性マジックを除染し、外科的使用のために専用にする必要があります。 </li></ol> 3注射用の細胞を調製<ol><li>ここに示した実験では、不死化ヒトGBM細胞株を選択します。セルの数（2×10 5）を、経験的に注入される懸濁液の体積（3μl）を決定します。詳細には、細胞型によって変化し得る。正確な測定、混合、および注入を容易にするために、少なくとも50μlの容量を使用してください。 </li><li>メディアまたはPBS中の細胞を再懸濁をトリプシン処理。細胞注入の直前に、次の手順を実行します。 <ol><li>吸引により細胞から培地を除去し、100mmプレート当たり10 mlのPBSですすぎ; PBSを除去します。 </li><li>広告各100mmプレートにd 1とmlのトリプシンとは、単一細胞懸濁液を得るためにちょうど十分な長さRTでインキュベートする。 </li><li> 100mmプレートあたり5ミリリットルダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+10％ウシ胎児血清（FBS）をトリプシン活性を停止します。 </li><li> 100mmプレートあたり〜5ミリリットルの無血清DMEM（SF-DMEM）中で450×gで遠心分離し、再懸濁することにより細胞をペレット化。 </li><li>血球計または自動細胞カウンターを用いて生細胞を数える。 </li><li> 2×10 5細胞/3μlのに生細胞密度を調整（または実験によって決定される）細胞をペレット化し、SF-DMEM中に再懸濁することにより。 </li></ol></li><li>氷や冷却パック（細胞が凍結することはできません）で冷却した細胞を保管してください。指のフリックにより穏やかに混合します。 </li></ol> 4。手術のために、マウスを麻酔し、準備する<ol><li> 〜5％のイソフルラン（酸素流量〜2リットル/分）を使用して麻酔を誘導または獣医師の指示として。誘導は、2から3分かかります。十分な深さでマウスを維持〜3％イソフルランで麻酔の。 <ol><li>つま先のピンチによって麻酔の深さを確認し、必要であればイソフルランを調整し、作業中は呼吸や足指のピンチ応答を監視し続ける。暖かさのためのガーゼパッドとマウスを覆い、注入速度に応じて、1時間に45分かかる場合があります手順、全体で定期的にマウスを監視します。 </li></ol></li><li>丁寧に舌の上や口の中に口蓋バーをスライドさせることにより、定位フレーム内にマウスを置きます。歯の穴に正面切歯フック。できるだけ水平に近いように耳 - 目の表面と、頭を安定させるために耳のバーを使用してください。外耳道に棒を強制しないでください。これは、安全にヘッドを位置決めすることが重要です。指先で軽くサイド側へと上下の動きをチェックしてください。フィット感を最適化するために、定位ユニットの調整可能なコントロールを使用します。 </li><li>眼軟膏で目を注油。ポビドン - iodinの交互の用途で二回目と耳の間の皮膚をきれいに電子防腐70％エタノール。 </li><li>フランク（または監督など）に選ばれた鎮痛剤の皮下（SQ）を注入する。 </li></ol> 5。噴射を行う<ol><li>注射部位を決定します。注射部位は、大きさやマウスの菌株及び細胞の種類によって変化し得る。脳室に近づきすぎて注入された細胞は、疾患の頭蓋脊髄普及につながる可能性があります。浅すぎる注入された細胞は、針トラックを通って成長することがあります。 注：ここに示した実験では、ターゲットは大脳皮質の前頭領域として定義されたサイトは、2.5ミリメートル（右）、1.5mmの前方、及びブレグマに対して3.5ミリメートル腹が選択された横方向（ 図1）、生産20〜30グラムの範囲の、マウスにおける脳の腫瘍。 </li><li>ブレグマと注射部位を露出させるために頭部の皮膚を通して無菌技術を用いて、小さな切開（〜8ミリメートル、長）を作成します。正中軸と右耳（に向かって、右眼との間の点から斜めカット、 <strong&gt;図2）は、ブレグマと注射部位の両方にアクセスすることができます。 </li><li>皮膚を撤回し、頭蓋骨の表面を乾燥させるために滅菌綿棒を使用しています。ブレグマを可視化するためにH 2 O 2で湿らせた綿棒で他の骨ブロット。 H 2 O 2は、ブレグマで交差冠状および矢状縫合糸に沿って白色の泡状の細い線を残し、酸素の泡を生成する。 </li><li>マイクロポンプに針の付いた空の注射器をロックし、前頂の上に直接、針の先端を操縦;セットには、0.0ミリメートル、横0.0ミリメートル前方/後方、及び0.0ミリメートル腹側/背側に整列コンソール上の座標。 </li><li>定位固定ユニットのコントロール·ノブを使用して、横2.5ミリメートル（右）とブレグマ（または希望の場所）に対する1.5mmの前方に針を移動します。少しシリンジを上げ、専用のサインペンで頭蓋骨上の正確な位置をマーク。頭蓋骨の外表面は、ブレグマと水平面上にない場合は、（i。E。、背側/腹側はもはやゼロを読み取って座標なし）、注入の深さがずれていないことを確実にするために0.0に読んで腹側/背側をリセットします。 </li><li>ステップ5.5のペンでマーク適切なサイトに無菌歯科先端装備、手持ち回転式ドリルで頭蓋骨に小さな穴を開けます。頭蓋骨の角度でドリルを持ち、非常に静かに骨に先端をタッチします。必要に応じて繰り返します。実際に頭蓋骨のこの層を貫通する針を残して、骨をほぼ完全ではないドリル、最もクリーン注射をもたらす。 </li><li> PBSまたは生理食塩水で湿らせた綿棒で骨のほこりを取り除きます。ポンプにシリンジを返すと場所を確認するためにまっすぐにバーホールに針を下ろします。バーホールを針でセンタリングされていない場合は、開口部を拡大するためのドリルを使用しています。 </li><li>静かに細胞懸濁液を混合し、ポンプコントローラを使用してシリンジ内にセルを描画。気泡や塊を避け、針のウィットを拭く外部表面上の汚染細胞を除去する時間アルコール綿棒。注射器/注射針が詰まったり凍結されている場合は、削除し、すぐに滅菌水できれいにし、70％エタノール。 </li><li>頭蓋骨の表面の高さ（0.0ミリメートル腹側/背側）に針を下ろします。そして、ゆっくりと（より約1分）頭蓋骨の全厚さを貫通し、4mmのventrallの深さに脳を貫通する針を下ろします。腹側3.5ミリメートルにゆっくり針を撤回。マウスヘッドが定位ユニットにしっかりと保持されている場合、頭蓋骨のほとんど動きがあってはならない。 </li><li>正しいパラメータが細胞をautoinjectするポンプ制御装置（2.2節）を押して「RUN / STOP」（または製品マニュアルの指示など）を締結していることを確認します。マウスを監視し、必要であれば、イソフルランを調整します。注射器を見て、プランジャーがバレルに移動していることを確認してください。冷凍または詰まっ動きが曲がっ/壊れたプランジャーになることがあります。 </li><li> B中の針を1から2分待ち雨は、その後非常にゆっくりと（3から4分かけて）組織から針を引き抜く。注入が完了した後、針を除去するための合計時間は5分である。バーホール周辺を覆い隠すために綿棒を使用してください。骨を乾燥させるために開いている皮膚のエッジを残す。 </li><li>ポンプから注射器を取り出し、すぐに70％エタノールで滅菌H 2 Oで3回3回すすぎ、および滅菌H 2 Oで3倍（またはメーカの指示どおりに）。 EtOHで針を拭き、脇に置きます。 </li><li>バーホールに（1または2μLに相当）を滅菌骨ろうを適用し、上におよび骨の中にワックスを固めるために滅菌綿棒の木の先端を使用。表面が十分に乾燥している場合は、固執する必要があります。 </li><li>マウスと周囲の作業領域の上に、滅菌ドレープを広げ、切開を縫合。 3ステッチで十分です。あるいは、外科用接着剤を使用することができる。局所抗生物質を適用します。 </li><li> 0％にイソフルランを削減し、定位ユニットからマウスを取り外し、Cであること歯を保護するためにareful。耳、口や舌をチェックしてください。 </li><li>密接に注射後のマウスを監視します。 5から10分間の熱パッドの上に置いてマウス;その後（熱パッドの上に）ケージに転送され、マウスが覚醒し、歩行可能になるまで観察します。それは胸骨横臥を維持するために十分な意識を取り戻したまでマウスを無人のままにしないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社にマウスを返さないでください。痛みの兆候が認めている場合、追加の鎮痛剤の使用を考えてみましょう。 </li></ol> 6。完了し、モニター回収·腫瘍の開発<ol><li> 70％エタノール、マウスの間のビーズ滅菌器や消毒剤を使用して、すべての楽器や機器を清掃してください。 </li><li>痛み、感染症や他の合併症の兆候が、処置後2日間注射したマウスを監視します。処置後24および48時間（または指示など）で鎮痛を注入。必要に応じて、7〜10日で縫合糸を取り除きます。 </li><li>疾患の臨床徴候についてマウスを評価、paralysisは、体重減少、発作、または一般的な病気の活性を減少させた。 </li><li> [ ビボイメージングシステム（IVIS） は 、磁気共鳴イメージング（MRI）など]の適切な方法によって腫瘍の発達を監視する。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もない。

ヒト脳癌の同所性マウスモデルは、臨床治療の有効性を評価するための優れたツールであるが、脳組織内の細胞の配置を最適化するために注意しなければならないことができる。腫瘍の大きさの研究過度のアリコート量、準最適な注入技術及び性急な注入速度が漏出し、望ましくない場所での腫瘍細胞の出現をもたらし得ることが示されている（脳室、脊髄、硬膜外の領域など ）と高...

脳腫瘍細胞のインビトロ研究は、増殖、生存、遊走、および癌細胞の浸潤を駆動する分子メカニズムを解剖するための非常に貴重である。培養細胞実験は、シグナル伝達経路を定義する潜在的な治療標的が示唆され、薬物治療に対する細胞応答を特徴付けることができる。しかし、in vitroでのシステムは、医薬品への生物の応答を予測するのはあまりにも単純化している。それらは生理的反応、免疫応答、細胞微小環境、および動物生体系の全体的な不均一性を欠いている。臨床観察を1に動物モデルを比較する際の重要な相違をもたらし、人間のプロセス内のイベントを再現しないことが可能な場合、遺伝子操作さのモデルは、非常に貴重なことができますが、分子の違いは種とマウス細胞の間に存在する。脇腹の皮下にヒト脳腫瘍細胞株の皮下（SQ）注射を含むマウス異種移植片モデルは、実行が容易であるおよび測定;彼らは、遺伝子改変および薬物投与/送達、代謝および毒性の影響に対処するために使用することができる。重大な欠点は、しかし、SQモデルの有用性を制限する。微小環境は、天然に存在する脳腫瘍の再現しない：さまざまな細胞型および組織の相互作用を;脳に特有のローカルな血管系、および無数の他の要因は複製することはできません。より正確に、天​​然に存在する脳腫瘍のユニークな環境を再現し、医薬品介入の効果をテストするには、マウス同所モデルが利用されるべきである。また、同所技術が人間の主要な非癌性細胞（分化した細胞または前駆）遺伝子操作されたアプローチの一部として使用することができる遺伝的に腫瘍形成が生じる、またはヒト間質細胞なしで、マウスの該当部位に変形して注入されるヒトの1に見られるものと同様。 この記事では説明して正確かつ再現性マウスにおいて脳腫瘍を作成するための方法論。この技術を使用して、ユーザは正確にマウス大脳皮質の前頭側頭頂側頭部の指定した場所に懸濁された細胞の小アリコートを注入することができます。マウスの死亡率は極めて低い。私たちの手の中に、全くマウスは185の手順の後に外科的合併症で死亡していない。得られた腫瘍の特性は、典型的なヒト臨床腫瘍のそれと比較することができる。例えば：などの成長速度、壊死の程度、浸潤の程度は、細胞型の異質性、有糸分裂細胞の存在、増殖およびアポトーシスのマーカー、細胞株または脱凝集ヒト組織または腫瘍サンプルは、次にそれらの能力に基づいて評価することができる実際の臨床プレゼンテーションをシミュレートします。それらは動物負担ウィット内に存在するように、細胞培養におけるそれらの性能に基づいて選択された医薬品は、代謝機能、循環系、および血液脳関門の文脈において試験することができるhaの腫瘍、関連する建築のコンテキスト内のすべての。さらに、注射用に選択された細胞は、遺伝的に腫瘍の増殖および生存に対する等の特定のノックダウン、欠失、ノックイン、突然変異の影響を調査するために修飾することができる。 多くの刊行物は、頭蓋内のさまざまな技術を用いて腫瘍の研究を文書化する。 Yamada らは、染料およびU87細胞の注射の詳細な研究を行なったし、最小化する量と噴射率が最高の腫瘍2を生成したことがわかった。 ブルックスらは、マイクロプロセッサ制御式のインジェクタではなく、ウイルスベクターを送達するための手動の方法を使用して、優れた再現性と効率性を発見した。最適噴射パラメータに関する彼らの結論は、細胞送達3にも適用可能である。 Shankavaram らは、多形性膠芽腫（GBM）細胞株を脳内に（手動による方法を使用して）同所注射したことを示したCLの遺伝子発現プロファイルを再現したinical腫瘍がより密接によりインビトロまたはSQ異種移植片において 、前臨床試験4のために頭蓋モデルの使用をサポートする。ジャンニーニらは、追加のマウスの脳内に連続継代によりヌードマウスの脇腹に維持されていた人間の手術標本から細胞を注入し、このアプローチは、モデル5で患者の腫瘍遺伝子変化を保っていることを示した。同様の結果は、李ら 6で報告された。定位セットアップ、慎重に定義注射部位、およびゆっくりと着実な注入速度を使用すると、彼らは一貫性のある成長率と高い（100％）の生着率で再現性の脳腫瘍を得た。この技術の有効性は、したがって、十分に確立されている。文献検索は、この技術の用途は広範囲であることを示唆している。カーティーらは、正常transgeniの前頭皮質中に治療遺伝子を発現するウイルスベクターを送達するための頭蓋内注射を使用アルツハイマー病7のCモデル。サチらは既に同所注入さGBM腫瘍8を担持するヌードマウスに神経幹細胞ベースの担体中に治療的腫瘍溶解性アデノウイルスを送達するための頭蓋内注射の使用を記載している。明らかに、頭蓋内注射は、前臨床研究のための汎用性と効果的なツールです。可視化実験のジャーナル以前の出版物は、基本的なアプローチ9-11を説明し、私たちは簡単にマスター技術を使用して、精度の高いレベルに頭蓋内腫瘍注射と同所モデリングの概念を取る。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td><td>Kopf</td><td>Model 923-B</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ear Bars</td><td>Kopf</td><td>Medel 922</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Illuminator</td><td>Fisher</td><td>12-562-36</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 microprocessor</td><td>WPI</td><td>UMC4</td><td></td></tr><tr><td>Variable speed hand-held rotary drill</td><td>Dremel</td><td>Model 300</td><td></td></tr><tr><td>Dental drill bit, 1.0 mm</td><td>Spoelting</td><td>514554</td><td></td></tr><tr><td>Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet</td><td>Dremel</td><td>481</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td></td><td></td><td>for mice</td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer system</td><td></td><td></td><td>for mice</td></tr><tr><td>Medical tubing and connectors</td><td></td><td></td><td>to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Precision 25 &amp;mu;l microsyringe</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td>7636-01</td><td>Model 702, without needle</td></tr><tr><td>Microsyringe needles, 26s G</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td>7804-04</td><td>RN, 25 mm point style 2</td></tr><tr><td>Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium-sized standard scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard serrated forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serrated hemostats (2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine-tipped forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon)</td><td>MWI</td><td>J463G</td><td></td></tr><tr><td>Surgical blades #10, stainless (Feather)</td><td>Fisher</td><td>296#10</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Fluriso)&amp;nbsp;</td><td>VetOne&amp;nbsp;</td><td>NDC 13985-528-60</td><td>Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.</td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml)</td><td>Pfizer</td><td>NDC 61106-8507-01</td><td>dilute in saline</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment (artificial tears)</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Topical antibiotic (AK-Poly-Bac )</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-238-35</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine)</td><td>Betadine</td><td>NDC 67618-150-04</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide, 30%</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>H325-100</td><td>for visualizing skull landmarks</td></tr><tr><td>Sterile saline</td><td>VetOne&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>NDC 13985-807-25</td><td>for diluting solutions, cleaning tissue</td></tr><tr><td>Bone wax</td><td>WPI</td><td>Item #501771</td><td></td></tr><tr><td>Sterile drapes</td><td>McKesson</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Sterile surgical gloves</td><td>McKesson</td><td>(to fit)</td><td></td></tr><tr><td>Sterile gauze pads, 2 x 2</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>22028556</td><td></td></tr><tr><td>Sterile gauze pads, 4 x 4</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol prep pads (medium)</td><td>PDI</td><td>B603</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cotton-tipped applicators</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>23-400-114</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells</td><td>USA Scientific</td><td>1405-4700</td><td>for cells</td></tr><tr><td>Individually wrapped sterile dispo pipettes</td><td>Fisher</td><td>BD 357575</td><td>for needle cleaning solutions</td></tr><tr><td>BD insulin syringes with needles&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>329461</td><td>for analgesic</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>for cleaning</td></tr><tr><td>Sterile diH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>for cleaning</td></tr><tr><td>Microfuge tubes for cleaning solutions</td><td></td><td></td><td>for needle cleaning solutions</td></tr><tr><td>Felt tip pen (dedicated)</td><td></td><td></td><td>for marking skull</td></tr></tbody></table>

creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors

特に脳のようなユニークな生理学的および建築資質を持つサイトにインビトロおよび異所性モデルができない-同所腫瘍モデルは、生きた動物のコンテキストで、現在で介入することなく、腫瘍の種類の特性を研究するための最良の方法です。そのような血管系、血液脳関門、代謝、薬物送達および毒性、およびその他の関連要因のホストなどの機能を占めている。同所性モデルもそれらの限界を持っているが、関心のある適切な手法腫瘍細胞を正確にはヒトの脳において最も密接に模倣する条件組織に移植することができる。一貫性の速度および圧力で正確に測定された容積を正確に定義するための場所を提供する方法を採用することにより、予測可能な成長速度を有するヒト脳腫瘍のマウスモデルが再現可能に作成され、さまざまな介入の信頼できる分析のために適切であることができる。ここに記載されているプロトコルは、TEに焦点を当てて設計および頭蓋内注射の準備、手術を行うと、成功したと再現性の腫瘍の成長を確保し、異なる脳の腫瘍モデルの範囲に合わせてカスタマイズすることができ、さまざまな条件のための出発点を提供するchnical詳細。

信頼性の高い頭蓋内異種移植片は、この記載された技術を使用して作成することができます。マウスの頭蓋骨（ 図1）の重要な構造を識別することはブレグマの認識を可能にし、正確で再現性の注入場所に調査員を案内します。これらの研究ではU251親系統は、ルシフェラーゼ（U251-Luc）、ノまたはU87でトランスフェクトしたU251細胞は、ヒトGBM組織培養細胞はSF-DMEMの4〜6μlの懸濁?...

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Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

脳はよくインビトロまたは異所性の分析によって示されていない資質を持つユニークなサイトです。再現性のある場所および成長特性を有する同所性マウスモデルを確実に定位固定装置及び低圧シリンジポンプを用いて頭蓋内の注射を使用して作成することができる。

解剖学的に正確な作成と人間の脳の腫瘍の再現性頭蓋内異種移植片

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

creating-anatomically-accurate-reproducible-intracranial-xenografts

Research

JoVE Journal

Medicine

15.5K ビュー.  University of Colorado School of Medicine. 脳はよくインビトロまたは異所性の分析によって示されていない資質を持つユニークなサイトです。再現性のある場所および成長特性を有する同所性マウスモデルを確実に定位固定装置及び低圧シリンジポンプを用いて頭蓋内の注射を使用して作成することができる。 

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Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most commonly used procedure for human tumor xenograft establishment consisted of the collection of cells from culture flasks, followed by the subcutaneous injection of the collected cells in immunocompromised mice. Whereas this approach still sees frequent use in many laboratories, there has been a significant shift in emphasis over the past decade towards orthotopic xenograft establishment, which, in the instance of brain tumors, requires tumor cell injection into appropriate neuroanatomical structures. Because intracranial xenograft establishment eliminates the ability to monitor tumor growth through direct measurement, such as by use of calipers, the shift in emphasis towards orthotopic brain tumor xenograft models has necessitated the utilization of non-invasive imaging for assessing tumor burden in host animals. Of the currently available imaging methods, bioluminescence monitoring is generally considered to offer the best combination of sensitivity, expediency, and cost. Here, we will demonstrate procedures for orthotopic brain tumor establishment, and for monitoring tumor growth and response to treatment when testing experimental therapies.

Luciferase-modified human brain tumor xenografts can be established intracranially in athymic mice, with subsequent monitoring of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. In combination with survival analysis, bioluminescence monitoring is an essential research tool for pre-clinical testing of therapies being considered for treating brain tumors.

生物発光イメージングを使用して腫瘍の成長や治療に対する反応のその後の分析では頭蓋内脳の腫瘍異種移植片の確立

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most ...

神経科学

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

マウスにおける頭蓋内異種移植研究のための簡単​​なガイドスクリュー方式

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

医学

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

定位頭蓋内注入と<emインビボ&gt;</em多形性膠芽腫のマウスモデル系における腫瘍異種移植片の&gt;生物発光イメージング

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

頭蓋内注射と磁気共鳴画像による脳転移のモデル化

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

がん研究

Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary orthotopic xenografts recapitulate the histopathological and molecular features of malignant glioma subtypes in preclinical animal models. To model WHO grades III and IV malignant gliomas in transplantation assays, human tumor cells are xenografted into an orthotopic site, the brain, of immunocompromised mice. In contrast to secondary xenografts that utilize cultured tumor cells, human glioma cells are dissociated from resected specimens and transplanted without prior passage in tissue culture to generate primary xenografts. The procedure in this report details tumor sample preparation, intracranial transplantation into immunocompromised mice, monitoring for tumor engraftment and tumor harvesting for subsequent passage into recipient animals or analysis. Tumor cell preparation requires 2 hr and surgical procedure requires 20 min/animal.

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary orthotopic xenografts recapitulate the histopathological and molecular features of malignant glioma subtypes in preclinical animal models.

原発性異形性神経膠腫は浸潤性の増殖とイソクエンテインゲナーゼI突然変異

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

同所神経膠芽腫モデルマウスは、脳実質細胞の物理的制約を維持し、生体内二光子顕微鏡に適し

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain tumors. Unlike xenograft tumors, in GEMs, tumors arise in the native microenvironment in an immunocompetent mouse. However, the use of GBM GEMs in preclinical treatment studies is challenging due to long tumor latencies, heterogeneity in neoplasm frequency, and the timing of advanced grade tumor development. Mice induced via intracranial orthotopic injection are more tractable for preclinical studies, and retain features of the GEM tumors. We generated an orthotopic brain tumor model derived from a GEM model with Rb, Kras, and p53 aberrations (TRP), which develops GBM tumors&#160;displaying linear foci of necrosis by neoplastic cells, and dense vascularization analogous to human GBM. Cells derived from GEM GBM tumors are injected intracranially into wild-type, strain-matched recipient mice and reproduce grade IV tumors, therefore bypassing the long tumor latency period in GEM mice and allowing for the creation of large and reproducible cohorts for preclinical studies. The highly proliferative, invasive, and vascular features of the TRP GEM model for GBM are recapitulated in the orthotopic tumors, and histopathology markers reflect human GBM subgroups. Tumor growth is monitored by serial MRI scans. Due to the invasive nature of the intracranial tumors in immunocompetent models, carefully following the injection procedure outlined here is essential to prevent extracranial tumor growth.

Here, we describe a preclinical orthotopic mouse model for GBM, established by intracranial injection of cells derived from genetically engineered mouse model tumors. This model displays the disease hallmarks of human GBM. For translational studies, the mouse brain tumor is tracked by in vivo MRI and histopathology.

多形性膠芽腫の並進同所性モデル

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of neuro-oncology. One of the most widely used techniques is the orthotopic intracranial injection, a method that allows investigating of tumor growth, invasion, and dissemination within a controlled setting. This technique involves transplanting tumor cells from a specific patient region into the corresponding anatomical site in an animal. By doing so, these orthotopic brain tumor models offer a unique advantage, as they more accurately replicate cancer's biological behavior and its interactions with the brain environment seen in human patients. This makes them especially valuable for preclinical therapeutic testing, where a close resemblance to the clinical scenario is essential for evaluating potential treatments. This protocol shares experiences in developing patient-derived xenograft (PDX) models for pediatric brain tumors, including diffuse midline glioma (DMG), glioblastoma (GBM), medulloblastoma, and ependymoma. This method delineates the procedure for conducting intracranial stereotaxic injections in mice, ensuring the correct targeting of the injection site within the brain. Additionally, we describe the post-procedural monitoring system employed to detect signs of successful tumor engraftment. Following tumor injection, a rigorous monitoring system is implemented to observe the animals for any signs of neurological impairment, behavioral changes, and/or weight loss, which are common indicators of tumor progression. This system allows for timely intervention and provides critical data regarding the tumor's growth dynamics. By refining these models and protocols, we aim to enhance the reliability and translational potential of preclinical studies, contributing to the development of more effective treatments for pediatric CNS tumors.

The development of orthotopic pediatric brain tumor models requires meticulous precision, using a stereotaxic device to implant cancer cells precisely. The methodology presented here outlines the steps involved in preparing brain tumor cells, performing intracranial injections, and implementing a post-operative monitoring system to assess brain tumor engraftment.

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

同所性同種人間神経膠腫異種移植片のマウスモデルの細胞傷害性免疫細胞の定位の養子転送

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

免疫・感染学

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

マウスモデルにおける膠芽細胞腫に対する治療用幹細胞の鼻腔内送達

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...

解剖学的に正確な作成と人間の脳の腫瘍の再現性頭蓋内異種移植片

要約

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生物発光イメージングを使用して腫瘍の成長や治療に対する反応のその後の分析では頭蓋内脳の腫瘍異種移植片の確立

マウスにおける頭蓋内異種移植研究のための簡単なガイドスクリュー方式

定位頭蓋内注入と

頭蓋内注射と磁気共鳴画像による脳転移のモデル化

原発性異形性神経膠腫は浸潤性の増殖とイソクエンテインゲナーゼI突然変異

同所神経膠芽腫モデルマウスは、脳実質細胞の物理的制約を維持し、生体内二光子顕微鏡に適し

多形性膠芽腫の並進同所性モデル

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

同所性同種人間神経膠腫異種移植片のマウスモデルの細胞傷害性免疫細胞の定位の養子転送

マウスモデルにおける膠芽細胞腫に対する治療用幹細胞の鼻腔内送達

解剖学的に正確な作成と人間の脳の腫瘍の再現性頭蓋内異種移植片

要約

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生物発光イメージングを使用して腫瘍の成長や治療に対する反応のその後の分析では頭蓋内脳の腫瘍異種移植片の確立

マウスにおける頭蓋内異種移植研究のための簡単​​なガイドスクリュー方式

定位頭蓋内注入と

頭蓋内注射と磁気共鳴画像による脳転移のモデル化

原発性異形性神経膠腫は浸潤性の増殖とイソクエンテインゲナーゼI突然変異

同所神経膠芽腫モデルマウスは、脳実質細胞の物理的制約を維持し、生体内二光子顕微鏡に適し

多形性膠芽腫の並進同所性モデル

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

同所性同種人間神経膠腫異種移植片のマウスモデルの細胞傷害性免疫細胞の定位の養子転送

マウスモデルにおける膠芽細胞腫に対する治療用幹細胞の鼻腔内送達

マウスにおける頭蓋内異種移植研究のための簡単なガイドスクリュー方式