この作品は、通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ（ジュンヌChercheuses / EFNへジュンヌChercheurs）、財団VOIRらEntendreと財団ベッテンコートSchueller（EFNに若手研究グラント）、センター国立デラルシェルシュ科学研究（CNRS、EFNのための恒久的な位置）によってサポートされていました、および国立衛生研究所の国立眼研究所（SCFにR01-EY13295）。さらに、研究所·デ·ラ·ビジョンは、デ·ラ·サンテらデ·ラ·ルシェルシュMédicale、大学ピエールマリー·キュリー·パリ6、センター国立デラルシェルシュ科学研究やデパート·ド·パリ研究所国立によって資金を供給されている。

このPOS分離実験は時間がかかり、POSは保存前標識されている場合は、完了するために12時間まで必要な場合があります。プロトコルは、1987年31でRSモルデイらによって発表された論文から適応し、1997年10でSC Finnemannらによって修正されている。 動物は、眼科と視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科（ARVO）計算書の研究のための協会による取り扱った。プロトコルは大学ピエールとマリー·キュリー·パリ06とフォーダム大学施設内動物管理使用委員会から見直し、チャールズ·ダーウィン倫理委員会によって承認された。 1.一般セットアップ<ol><li>できるだけ早く屠殺した後、新鮮な80新鮮な豚や牛の目を入手して、暗闇の中で冷蔵保管してください。会社が同じように進行するようにプロバイダに指示を与える。このプロトコルは、80の目のために最適化されています。へもっと目を進め、より大きな株式を取得する（ 例えば、160目から）、ソリューション量を倍増し、超遠心分離の2ラウンドを行う。プールのサンプルは、後の収集ステップ（ ステップ2.2.2を参照）。 </li><li>赤いセーフライトランプ、吸収パッドはベンチに設定し、（ 材料表 ） を拭き取る。廃棄物収集（未使用の眼の部品、ガラス質の...）のために15cmの皿とバイオハザードバッグを準備します。タイトフィットlabcoat、手袋、スリーブプロテクタとゴーグルを着用してください。 </li><li>注意事項： <ol><li>すべてのソリューションは、すべてのステップの間に冷たいそれらを保つ事前冷やす。できるだけ多くの氷上で冷却目とグラデーションにしてください。 </li><li>視覚色素と光色素の活性型のオレンジ-ピンク色の損失の光退色を避けるために、超遠心分離後の回収工程まで、可能な限り多くの暗闇の中で目や由来の組織にしてください 。 </li></ol></li></ol> 2.プロトコルアクション<ol><li> ソリューションや勾配を準備します。 <ol><li> 37℃の水浴を用いて完全にタウリンストックを解凍する。 </li><li>ストック溶液（ 表1、ストック溶液）からのすべてのソリューションを準備し、各ソリューションのための磁気攪拌機を使用して他の成分で十分にショ糖を混ぜて。 <ol><li> 20％ショ糖の最終濃度に均質溶液15mlを調製し、20 mMのは、2のMgCl 2、10mMのグルコースおよび5mMのタウリンを酢酸pH7.2のトリス。 </li><li> （70％スクロースストックを使用して）、25％スクロース、20mMのトリス酢酸pH7.2で、10mMのグルコースおよび5mMのタウリン、最終濃度25％スクロース溶液を調製する。 </li><li> （ショ糖粉末を使用して）60％のショ糖の最終濃度は60％スクロース溶液を調製し、20mMの酢酸塩pH7.2で、10mMのグルコースおよび5mMのタウリントリス。 </li><li> 20 mMのトリス酢酸pHは7.2と5 mMのタウリンの最終濃度まで洗浄1溶液を調製する。 </li><li>ウォッシュ2溶液を準備10％スクロース、20mMのトリス酢酸pH7.2の5 mMのタウリンの最終濃度にした。 </li><li> 10％スクロース、20mMのリン酸ナトリウムpH7.2の5 mMのタウリンの最終濃度まで洗浄3溶液を調製する。 </li></ol></li><li>マグネチックスターラー上勾配メーカーを着実にし、60％溶液が挿入される出口に最も近いチャンバー内の攪拌棒を挿入します。適切な鋳造速度を達成するために、チューブの出口に配置されたカットオフP200のピペットチップを使用してください。 </li><li>予備冷却超遠心チューブに各溶液から12ミリリットルを用いて25％の1（80目のためすなわち、合計6管）60％ショ糖溶液を希釈し、攪拌することにより微妙に線形グラデーションをキャストします。よく徐希釈60％スクロース溶液を撹拌した。速すぎてスムーズにしない溶液を注ぐ、勾配流速を安定。 注：連続、線形勾配を得るために、右全体勾配のための溶液の表面にピペットチップ開口部を維持formatioN。 </li><li>勾配が安定化のために約1時間、氷の上に座ってみましょう。ロードされるまで冷やし勾配を保管してください。勾配の破壊を防ぐために、チューブを振らないでください。 </li></ol></li><li> 組織収集： <ol><li>暗赤色灯の下での組織を収集します。片手に目を取り、離れて目を保持しながら、カミソリの刃のエッジと正面を突く（飛散を避けるために、 図1）。 2半分（角膜プラス強膜に少なくとも5ミリメートル）に前方眼球をカットするカミソリの刃を使用してください。レンズを取り外し、それは、このように網膜を露出する1指の先端の上に保持できるように裏返しにアイカップを反転。 </li><li>角度でカミソリの刃を使用して、優しく簡単に取り外しとタペート表面から、ピンクがかった層として現れると視神経乳頭（ 図1）で切断、網膜をこすり。 2×50ミリリットル管氷上で均質化溶液15mlを含む各内のすべての網膜を収集します。 </li><li> 網膜ホモgenization： <ol><li>異なる細胞層を破壊PR細胞、断片POSの残りからPOSを破壊し、網膜の懸濁液を均質化するために、2分間手で激しく懸濁液を振る。 </li><li>大きな組織片を除去し、清潔な50mlチューブ（ 図1）において、フロースルーを収集するために清潔なガーゼの二重層を通して3回濾過する。収量を最大化するために、非常に厚いという網膜の懸濁液は、静かにそれぞれの濾過後に残った断片化された組織を解放するためにガーゼに押します。 </li></ol></li></ol></li><li> 光受容体外側セグメント断片（POS）の分離： <ol><li> 60％ショ糖勾配（ 図1） -各生鮮冷蔵連続25の24ミリリットルを含む超遠心チューブ、チューブあたり7mlの30×6オーバーミリリットルを-優しく6の周囲に、原油網膜の準備を築く。ローターを使用するために、必要に応じて、対向するチューブのバランスをとる。 4℃で50分間の106000×gで超遠心機。 </li&gt; <li>吸引（ 図2A）により勾配の上部3分の1で、オレンジ·ピンクバンド上記溶液の大部分を削除します。ビーカーにカットオフP1000の先端でオレンジ - ピンクバンドを収集します。漂白剤（生物学的な廃棄物）を使用して中和した後、残りを捨てる。 </li><li>氷冷洗浄1溶液の5ボリューム - 〜4で希釈します。必要な数の30ミリリットルチューブに区切ります。 4℃で10分間3000×gで遠心し。注意深く上清を捨てる。 </li><li>上記で詳述したように10ミリリットル中に再懸濁ペレットを10分間3000×gで2溶液とスピンを洗ってください。 15ミリリットルに再懸濁ペレットは3を洗浄し、10分間3000×gで再びスピン。ウォッシュ2に遠心分離前に必要な管の数を減らし、3ソリューションを洗浄するためにいくつかのペレットからの懸濁液を組み合わせる。 </li></ol></li><li> 標識なし等分POS： <ol><li> 20mlのDMEM - 10に再懸濁POS。 490μlのDMEM中で事前希釈10μL（1:50）とに長いだけでなく、旋回POSをカウント細胞計数室（ 図2B）。 mL当たりPOS粒子中の収量と濃度を算出する。 注： - 80ブタの目から8×10 9 POS収率は例えば 、豚/牛や目の大きさの年齢および株にほとんどが異なり、良い準備が5の範囲である。 </li><li>最終DMEM量を決定（典型的には10〜20ミリリットル）および2.5％スクロースの最終濃度を得るためにスクロースを加える。 </li><li> /ウェル40μlの96ウェル実験用の2ミリリットルの再懸濁ボリュームの所望の大きさの分量を準備し、 例えば、チューブ当たり5×10 7 POS。 RTで2300×gで5分間の1アリコートをスピンし、ペレットサイズを評価する。 POSは二回凍結融解されるべきではない別のアプリケーションボリュームのための様々な分量のサイズを準備します。 </li><li>さらに使用するまで-80℃でのPOSアリコートをフリーズします。 注：一定量を何ヶ月も安定している。私たちの手では、未標識または標識POSは少なくとも1年間保存することができる。 </li></ol></li><li> POS標識および分注 ： 注：我々は、典型的には、食作用アッセイの定量化のためにPOSを標識するためにFITCを使用するが、他の染料は、必要に応じて用いてもよい。 <ol><li> 1.4ミリリットルの0.1MのNa 2 CO 3のpH 11.5（ 表2、ストック溶液）で2.6ミリリットルの0.1MのNaHCO 3 pHが8.4を混合することにより、0.1MのNa炭酸緩衝液pH 9.5で2.5 mg / mlの濃度で再懸濁し、1 10mgのFITCバイアル。非再懸濁FITC固形物をペレット化し、最大速度で5分間光とスピンから保護しながら室温で1時間回転させます。 </li><li>ウォッシュ3溶液（またはDMEM）10ml中のPOSペレットを再懸濁し、80目にFITC溶液の2ミリリットルを追加します。 -80℃で凍結残り物FITC保管してください。 RTで少なくとも1.5時間、回転させます。アルミ箔を用いて光から保護する。 </li><li> セクション2.3.4で説明したようにほとんど無料でFITCが上澄みFで見られなくなるまで、その後一度か二度DMEM中で、二回洗浄3溶液を用いて標識POSを洗うraction。 DMEMに再懸濁POSおよび計数及び分注（ セクション2.4）のために、非標識POSのための手順。 </li></ol></li><li> 実験でPOSを使用する： <ol><li>解凍RTでPOS、それらが蛍光標識である場合、できるだけ多くの暗所に保管してください。 RTで2300×gで5分間スピン。上清を吸引除去する。 </li><li>実験によって決定されるように、すぐにアッセイ溶液の適切な容量の懸濁します。 POSチャレンジの異なる時間の場合には、ストアは、数時間の時間点の間暗所でRTにてPOSを再懸濁した。 </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

3段階の条件が最適化された精製のために重要である：収集ステップまでの勾配鋳造の品質と繊細なグラデーション管操作、チルド組織を維持し、暗闇の中で、PRの残りの部分から適切なPOSアイソレーションを得るために、網膜ホモジネートの揺れの強さセル。いくつかの問題が適切にオレンジ色のバンドを見に発生した場合、それらは、上記の3つの理由の1（また結果セクション</strong...

網膜では、ビジョンは、脳内の視覚野までの神経細胞との間で伝送することができる信号に変換される前に、オプシンと呼ばれる感光性分子の異性化によって誘発される。これらの分子は、光受容細胞の外節部（PRの）を構成するパンケーキに似た膜状ディスクのスタック内に埋め込まれている。光酸化ストレス、したがって、かなりのレベルまで一定の曝露を受けること、PRは、連続的に潜在的な酸化的損傷を制限するために、それらの外側のセグメントを更新する。光受容体外側セグメントは、隣接する網膜色素上皮（RPE）細胞の頂端微絨毛に密着している。 RPE細胞は、血液網膜関門の外側部分を構成し、このようなメラニン色素、光反応性オプシン成分レチナールの再異性化、栄養素を提供するとgを介して光線を急冷などの光受容体の健康と機能1に重要である多数のタスクを確実にPR代謝物処分に参加し、要因をrowth。 また、RPE細胞は、POSを過ごしたとそのコンポーネント、哺乳類の網膜2,3に概日リズムによって調節されている毎日の占領をリサイクルなくす。小屋のPOSのクリアランスは、PRの生存のために絶対に必要である。それが完全に廃止されると、POSの破片が蓄積し、PRSは急速な失明の4,5の原因と縮退。リズミカルなプロファイルが失われ、一定の活動に置き換えている場合は、PRおよびRPE欠陥が6歳に蓄積する。したがって、その機能不全にリンク表現型を理解するために、インビトロでの RPEの食作用の分子の調節を特徴づけるために非常に重要である。興味深いことに、RPE細胞における分子機構は、アポトーシス細胞をクリアするためにマクロファージによって使用されるものと非常に似ており、両方とも、食破片7-9の露出したホスファチジルセリンの認識に依存している。それでも、RPE細胞およびマクロファージがphを調節マクロファージが遭遇時のアポトーシス細胞の即時撤廃を選ぶようagocytosisは異なって、RPE細胞は、リズミカルに外節との永続的な接触にもかかわらず、一日一度だけPOSを巻き込むながら。これは、まだ完全に理解されていない特定の調節メカニズムを示唆している。 RPEの食機械に関与する分子の多くは、孤立したPOSおよび細胞培養食作用アッセイの使用のおかげで同定または検証されています。 RPE頂端細胞表面に位置alphavbeta5インテグリン受容体は、そのリガンドMFG-E8と連携して、その後MERTKチロシンキナーゼ受容体13-15を介して内在化されるPOS 10-12に特異的に結合する。 CD36スカベンジャー受容体は、POS摂取に関与し、その速度16,17に影響を与えることが示されており、POS面18における酸化リン脂質のセンサーとして機能するかもしれない。内在化は、F-アクチン細胞骨格-尻の動員を必要とするそのようなアネキシン2 19、ミオシンII 20とミオシンVIIA 21,22としてociatedタンパク質。 インビトロでのネイティブまたは酸化POSも乏しい消化酸化さPOS 23-28の蓄積に連結されたインビボでの RPE細胞の老化の表現型を理解するために利用される。幹細胞由来のRPE細胞の生成は、それらが動物または患者29,30,27に移植する前に、細胞の機能性を証明するために使用される単離されたPOS用の新しいアプリケーションを開始した。 まず1987年31モルデイらによって記載され、ウシPOSの単離のためのプロトコルは、（11- シスレチナールを運ぶ）無漂白レチナール光色素の特徴オレンジ色の外観の観察と連続ショ糖勾配上の網膜ホモジネートの超遠心分離ステップを兼ね備えています。過去10年間に、狂牛病の危険性を最小限にするために取ら予防のためには、ブタの眼の使用がincreasiとなっているngly目立つ。ここで説明するプロトコルは、ブタまたは等分して、長期間保存することができるウシ目からPOSを大量に取得する方法を示します。これは、POS調製及びアッセイ32,33,21,22当たり多数の動物を使用する必要が齧歯類目からPOSを用意する必要がなくなる。また、蛍光分子を使用して保存前のPOSラベル付けについての詳細は食作用アッセイ32,10の後、標識POSに比べていくつかのアプリケーションのために簡略化し、比較可能な方法でPOSを定量化し、可視化するために、与えられている。したがって、これらの大型株を実験の多くの異なる種類で再現性と使いやすさを可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Specific Material/Equipment</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">2-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>gradient maker with 30-ml chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">3-mm diameter silicone tubing</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>tubing for gradient casting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">small size magnetic stir bar</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>stir bar fitting the gradient maker chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">red safelight lamp</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>inactinic lamp for dissection in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Clear 25x89 cm tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>ultracentrifugation tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PP Oak Ridge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td>30-mL centrifugation tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima LE-80K&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>365668</td>
			<td>ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 32Ti swing rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>369694</td>
			<td>swing rotor for ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avanti J-26 XP</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393124</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-25.50 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>363058</td>
			<td>rotor for Avanti J-26 XP centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FITC Isomer I</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>F-1906</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Other Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">counting chamber (such as Neubauer or Malassez)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dark ice buckets with lids</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scales</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stirrer and upholding pole</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refrigated microcentrifuge</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37 &#176;C water bath</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">-80 &#176;C freezer</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">labcoat</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Health and safety</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gloves</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sleeve protectors</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">googles</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">absorbent pads</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biohazard trash bags and bins</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm plastic dish</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile gauze sheets</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15- and 50-mL tubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Common consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">aluminum foil</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale purification of porcine or bovine photoreceptor outer segments for phagocytosis assays on retinal pigment epithelial cells

網膜色素上皮（RPE）細胞は、光受容体の外側セグメント（POS）の過ごし熟成末端断片の食作用の重要な機能の一つの分析は、 インビトロで行うことができる。光伝達機構を含む膜状のディスクのスタックを持つ光受容体の外側セグメントは、連続して網膜にリニューアルされている。使用済みPOSは、RPE細胞によって毎日排除される。齧歯類、ブタ/ウシおよびヒトRPE細胞は、同様に、様々な種からのPOSを認識する。小さな変動を用いた実験の大規模シリーズを実行しやすくするために、POSの大きい株式は、ブタの眼から単離し、そしてアリコートで凍結保存することができる。このプロトコルは、暗所に保存するとき、オレンジ色を表示する光色素の特性を利用しています。暗赤色灯の下では、半分にカットしオープンしたアイカップからバッファに網膜収集されます。網膜細胞懸濁液を均質化し、濾過し、そして連続的なスクロース勾配上にロードされる。 CENの後trifugationは、POSを特徴オレンジ色のグラデーションの上部に分離したバンドに位置している。 POSは、次いで、収集紡糸、洗浄緩衝液で連続的に再懸濁し、計数し、等分している。このようにして得られたPOSは、POSチャレンジ後の種々の時点で食作用アッセイおよびタンパク質活性化、局在、または相互作用の分析のために使用することができる。代替的に、POSは、フルオロフォア、 電子 。 グラムで標識することができる。、FITC結合POSまたは飲み込みの後続の蛍光定量に等分する前に。他の可能な用途は、酸化的ストレスまたはRPE細胞の老化の影響を研究するためにストレス条件と組み合わせて改変POSまたはPOSチャレンジの使用を含む。

線形スクロース勾配超遠心分離の組み合わせは、密度による網膜懸濁液の異なる成分の分離を可能にする。ヘビー大きな網膜破片とRPE細胞は、勾配（ 図2A）の底にまたはその近くに沈む。網膜からライターPOSおよび軽量化、個々の細胞または細胞破片を遠心分離期間の終了により勾配の上半分に到達するために別々のバンドとして移動する。遠心分離工程後まで目、暗所でサン?...

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Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

網膜色素上皮細胞に貪食アッセイのためにブタまたはウシの感光体外側セグメントの大規模精製

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

large-scale-purification-porcine-or-bovine-photoreceptor-outer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K ビュー.  INSERM, U968. This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.

ビデオ: Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

免疫・感染学

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

高収率の精製<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</emオプソニン抗体アッセイにおける使用のための&gt;メロゾイト

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles (MPs) are one such type of vesicles, ranging in diameter from 0.1 &#956;m to 1 &#956;m, and typically shed from the plasma membrane of eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. Here we describe the generation of T lymphocyte&#8211;derived microparticles (LMPs) from apoptotic CEM T cells stimulated with actinomycin D. LMPs are isolated through a multistep differential centrifugation process and characterized using flow cytometry. This protocol also presents an in situ cell death detection method for demonstrating the proapoptotic effect of LMPs on bronchial epithelial cells derived from mouse primary respiratory bronchial tissue explants. Methods described herein provide a reproducible procedure for isolating abundant quantities of LMPs from apoptotic lymphocytes in vitro. LMPs derived in this manner can be used to evaluate the characteristics of various disease models, and for pharmacology and toxicology testing. Given that the airway epithelium offers a protective physical and functional barrier between the external environment and underlying tissue, use of bronchial tissue explants rather than immortalized epithelial cell lines provides an effective model for investigations requiring airway tract tissue.

Cell membrane&#8211;shed microparticles (MPs) are active biological vesicles that can be isolated and their pathophysiological effects investigated in various models. Here we describe a method for generating MPs derived from T lymphocytes (LMPs) and for demonstrating their proapoptotic effect on airway epithelial cells.

気道上皮細胞上でのアポトーシス促進効果のリンパ球微粒子および検出の生成

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

レジオネラ・ニューモ外膜小胞：マクロファージ上における炎症誘発ポテンシャルの単離と解析

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and inflammatory intractable diseases. We herein developed an experimental method to investigate phagocytosis quantitatively using the fruit fly Drosophila, in which the gene network controlling engulfment reactions is evolutionally conserved from mammals. In order to accurately detect and count engulfing and un-engulfing phagocytes using whole animals, Drosophila embryos were homogenized to obtain dispersed cells including phagocytes and apoptotic cells. The use of dispersed embryonic cells enables us to measure in vivo phagocytosis levels as if we performed an in vitro phagocytosis assay in which it is possible to observe all phagocytes and apoptotic cells in whole embryos and precisely quantify the level of phagocytosis. We confirmed that this method reproduces those of previous studies that identified the genes required for the phagocytosis of apoptotic cells. This method allows the engulfment of dead cells to be analyzed, and when combined with the powerful genetics of Drosophila, will reveal the complex phagocytic reactions comprised of the migration, recognition, engulfment, and degradation of apoptotic cells by phagocytes.

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

We herein describe a phagocytosis assay using the dispersed embryonic cells of Drosophila. It enables us to easily and precisely quantify in vivo phagocytosis levels, and to identify new molecules required for the phagocytosis of apoptotic cells.

アポトーシス細胞の食作用アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

唾液圏または単層としての体外増殖のためのヒト唾液腺からの唾液上皮細胞の単離

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...