我々は図2に示されたデータのために人間の手術標本を提供するための博士Hesham Abdelbaryに感謝したいと思います。

1。組織の処理<ol><li>最良の結果を得るには、このプロトコルは、新たに分離した組織を使用して実行する必要がありますFBS、1％のPennicilin /ストレプトマイシンソリューション、および0.1％の前処理にAmphothericin B液直後の手術を10％含むDMEM培地に堆積。これが不可能な場合、組織は、処理前に4℃でこの培地で一晩放置することができます。 </li><li>サンプルを処理する前に、少なくとも5分間70％エタノール溶液でそれらを堆積することにより、金属の鉗子と替刃を殺菌する。また、10％含むDMEM培地2mlのFBS、1％のPennicilin /ストレプトマイシンソリューション、および0.1％Amphothericin Bで24ウェルプレートを準備</li><li>滅菌ピンセットを用いて層流の細胞培養フードに組織サンプルを収集し、側で無菌側の蓋を最新の状態に保ち、空の15センチメートルペトリ皿の中で組織を預ける。 </li><li>細胞培養のフードでは、図1のように組織内の領域の様々な異なるコアを得るために2ミリメートル生検パンチを使用してください。それらは容易に水平軸に沿って切断することができるように各コアの間に十分なスペースを残し、鉗子の助けを借りて、15cmのシャーレの蓋にコアを預ける。 </li><li>図1のように滅菌カミソリの刃を使用して、4さえ四半期に各コアを分割する。 </li><li>すでにFBS、1％のPennicilin /ストレプトマイシンソリューション、および0.1％Amphothericin B液を10％含むDMEM 1.5 mlを含む、図1のようにA1〜A4の異なるウェル内の特定のコアから各コアの四半期を入れ、ピペットチップを使用して。各コアについて、この手順を繰り返します。与えられたウェル/条件でバイアスを最小限に抑えながらこれは、腫瘍の代表的なサンプリングを許可する必要があります。よりよい表現のために、コアの数を増やす。 </li></ol> 2。組織生存率の評価<ol><li>図1に示すように、5％CO 2で加湿インキュベーター中37℃で1時間インキュベートとして以下の組織の処理は、よく＃A1と＃A2に25μlのアラマーブルーを追加します。 </li><li>アラマーブルーを持つ以下のインキュベーションでは、それぞれA1とA2井戸から3倍の100μlを削除し、96ウェルプレートの6つの異なるウェルに移す。蛍光プレートリーダー（530励起、590放射）を使用して信号を読み、自分の記録用データを保持。 </li><li>アラマーブルー信号が読み取られた後、DMEMを含むだけでなくA1からC1までピペットチップを使用して、組織のすべての部分を、転送、10％FBS + PS + AmphoB。よくA1からメディアの過剰な量を転送しないように注意してください。 </li><li> GFP発現とメディアの25μlで希釈したルシフェラーゼ発現ワクシニアウイルスの10 6 PFUとそれぞれのウェルA3とA4に感染する。よくA2は全くいないことも含ま任意の導入遺伝子を発現するウイルスに感染することができます。 </li><li> 72時間後、井戸C1とD1に25μlのアラマーブルーを追加し、ステップ2.2を繰り返します。 </li></ol> 3。蛍光顕微鏡によるGFP遺伝子発現の可視化<ol><li>良い蛍光写真を撮影するために組織片をカバーするすべての細胞培養培地を削除します。 </li><li>蛍光対応の解剖顕微鏡を使って、最初に適切な解像度で、位相コントラスト像を取る</li><li>蛍光モードに切り替わり、この場合のGFPで、興味のある遺伝子を可視化するために適切なフィルタを使用して撮影してください。 </li><li>バックグラウンド蛍光の写真を撮るために興味のある遺伝子（例えばRFPなど）のことから、可能な限り別の波長の蛍光フィルターを使用して、 </li></ol> 4。 in vivoイメージングシステム（IVIS） で使用してルシフェラーゼ発現の可視化<ol><li>作業を始める前にIVISが初期化されていることを確認します。 </li><li>井戸A4およびB4に、ルシフェリン基板10 mg / mlの5μlを追加、よく混ぜ、室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 5秒にIVIS露光時間を設定し、井戸の写真を撮る。画像が飽和状態になる場合は、下の露光時間で繰り返す。信号がない場合、露出時間を増やします。 </li><li> IVISイメージングソフトウェアを使用して、よくB4からの信号を使って背景を削除し、発光シグナルを定量化するために関心領域を選択することができます。 </li></ol> 5。プラークアッセイによるウイルス力価を評価<ol><li>ウイルス力価を定量する前に、組織は、最初にウイルス粒子を解放するためにホモジナイズされている必要があります。 -80℃で保存されていますこれは、感染した組織サンプルで数ヶ月後に行うことができます。 </li><li>分析スケールを用いて均質化する必要があるサンプルを秤量する。このケースでは、我々はよくA2から収集したサンプルを使用します。 </li><li>組織は、5 mlのポリスチレン丸底ファルコンチューブになって置いて、1mlのPBSを加える。組織ホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズする。必要に応じて、後で一度にウイルス力価の評価のために-80ホモジ​​ネートを格納する。 </li><li> 、力価ワクシニアウイルス、最初のプレート6ウェルプレートで100万U2OS細胞へと37度で一晩インキュベート5％CO 2の湿潤な彼らは翌日のコンフルエンシーが約95％に達していることなど化されたインキュベーター。 </li><li>各希釈段階の間にヒントを変更することを確認し、ウイルスの連続希釈を行うために無血清培地を使用してください。一般的に我々は10希釈で1を行い、900μlのに転送するために100μlのを使用してください。どのように多くの希釈作られて予想されるウイルス収量に依存します。 </li><li>希釈液を作るに続いて、U2OS細胞に感染するために希釈したウイルスストックの500μlのを（各希釈用）を追加してメッキU20S細胞をカバーするメディアを取り出してください。 5％CO 2の加湿インキュベーター中37℃で1時間分のために細胞をインキュベート。 </li><li>この時間の間に、DMEM 20％FBSを含有する濃縮2 X、および37度の水浴で3％CMC溶液をウォームアップ。 </li><li> 1時間のインキュベーションの後、感染したU2OS細胞をカバーするメディアを取り出してください。一緒に2X DMEM、20％FBSおよび感染U2OS細胞の各ウェルをカバーするためにこの混合液2 mlを使用して：3％CMCの1:1のボリュームを混在させる。 </li><li>別の48時間、37度5％CO 2の加湿インキュベーターに戻し、細胞を置く。 </li><li> 48時間後、各ウェルにおけるCMCオーバーレイの上にメタノールと酢酸の固定液2 mlを加えると細胞培養フードで10分間室温でインキュベートする。 </li><li>固定オーバーレイを破棄し、水道水を使用して、井戸の残りを洗い流してください。 </li><li>ウェルあたりのクマシーブルー溶液を2ミリリットルの固定U2OS細胞を染色し、プレートシェーカー上で、低速度で、室温で30分間インキュベートする。 </li><li>クマシーは井戸から染色や水道水を使用してプレートを洗浄取り外します。時間程度の蓋で乾燥することができます。 </li><li>結果としてウイルスプラークは、図2Cで簡単に可視化することができます。プレートは、この段階で無期限に保存することができます。 </li><li> 10〜100プラークが表示されている希釈段階でプラークをカウント。 </li><li>使用される希釈によりカウントされたプラークの数を乗算し、PFU / mlの力価を与えるために2で、結果の数値を掛ける。 25プラークが十分にカウントされている場合たとえば、100万倍希釈が使用されていたところ、初期の未希釈サンプルの力価は、2または5000万PFU / mlに掛けた1百万掛けた25です。さらに当初はPFU / gで力価を報告するサンプルの測定重量によってこの数を割る</li></ol> 6。代表的な結果： 正確に外科的に得られた腫瘍/正常組織のサンプルがあるか、ウイルス感染の可能性がないかどうか、一つは最初の組織サンプルは、実行可能な以上になることを確認する必要がありますが。決定するために図1Aは、生存率が代謝色素（アラマーブル）とその正常と腫瘍の両方の組織を用いて評価できることを示し、少なくとも72時間の期間にわたって代謝的に活性なままにしておくことができます。これは、組織培養ex vivoでのウイルス複製をサポートできることを示唆している。腫瘍溶解性ウイルスの重要な利点は、治療またはイメージング導入遺伝子を発現するように設計できることです。図2D - Eは、GFPやルシフェラーゼが、さらに、これらの組織は生存しても感染の可能性のあることを支持する、ex vivoで感染した組織から検出できることを示しています。増加した導入遺伝子の発現は、一般的にウイルスの複製に関連付けられているが、必ずしも治療活性に重要であると考えられている、自己増幅し、普及につながる生産的なウイルスのライフサイクルとイコールではありません。このような理由から、それはより多くのウイルスが最初に組織を感染させるために使用されたものよりも生産されているかどうかを判断する必要があります。図2Bは、感染直後に採取した組織してプラークアッセイによるウイルス定量の際に、より多くのウイルスが72時間の感染後に得られることを示しています。全体的に、これらのデータは、外科的に切除した腫瘍組織は時間ウイルスの複製をサポートすることができる中に、少なくとも72時間の期間については細胞培養中で実行可能な状態を維持できることを示している。 <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。プロトコルをサンプリング/切片組織の概要。組織サンプルは、その後、無作為に井戸A1 - A4に配布される4分の4に分割されているいくつかの2mmのコアを除去することによって処理されます。カラーコードは、各ウェルに用いる試薬を示している。井戸内の灰色の網掛けの四角は、描かれた6個のコアから各四半期を表す。よくA1の組織は、初期のアラマーブルーの読書の後にメディアを使用して、新しいだけでなく（C1）に転送されます。第二読会は、ウイルスによる72時間のインキュベーションの最後に実行されます。ウェルズA4とB4は、72時間のインキュベーション後の感染後にルシフェリンで補足されています<img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。患者組織サンプルの実行可能性と感染力。 a）組織の生存率は2時間と72時間後にコレクションにアラマーブルの信号で測定される。 Y軸は空白のアラマーブルーの信号を補正した表します。B）ワクシニアウイルスの力価組織サンプル2および72時間後に感染。Cクマシー染色。D以下のU2OS細胞のワクシニアウイルスのプラークの）例）患者VV -ルシフェラーゼ-感染組織から得られた発光信号のグラムごとに収集されたIVISを用いて画像化。E）は、蛍光顕微鏡画像は、 VV - GFPに感染した患者の組織サンプルの。

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+study+of+oncolytic+HSV+GM-CSF+in+combination+with+radiotherapy+and+cisplatin+in+untreated+stage+III/IV+squamous+cell+cancer+of+the+head+and+neck.">Phase I/II study of oncolytic HSV GM-CSF in combination with radiotherapy and cisplatin in untreated stage III/IV squamous cell cancer of the head and neck.</a> Clin Cancer Res. 16, 4005-4015 (2010).</li><li>Lal, R., Harris, D., Postel-Vinay, S., de Bono, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reovirus:+Rationale+and+clinical+trial+update.">Reovirus: Rationale and clinical trial update.</a> Curr Opin Mol Ther. 11, 532-539 (2009).</li><li>Park, B. H., Hwang, T., Liu, T. C., Sze, D. Y., Kim, J. S., Kwon, H. C., Oh, S. Y., Han, S. Y., Yoon, J. H., Hong, S. 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利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルの重要なステップの1つは、新鮮な組織サンプルを得ることである。サンプルが不適切なメディア（例えばPBS）で、手術室での長い待ち時間は、次の細胞培養に配置されている場合、これは組織の存続を危うくし、感染力を防ぐことができます。注目すべきは、正常組織は本質的に腫瘍組織に比べて、これらの影響を受けやすいです。もう一つの重要なポイントは、組織とそのサイズの一貫性をサンプリングするために使用するコア数です。このような組織の低酸素状態とinfectectable面などの要因は、コアとコアの四半期のサイズに応じて変動しますので、サイズの不一致は、患者サンプル間のばらつきにつながる。このは部分的に組織スライサーを使用して解決することができますが、ここで説明した方法の一つの利点は簡単にamenableはないソフトや粘性組織を含めて、、それは比較的容易であることが汚染を受けにくい、と組織の種類の多様に広く適用可能であるスライス組織へ。特に、コアの数は、よりよい組織の表現を得るために増加することができます。また、コアはそのようなDNA、RNA、またはタンパク質の抽出と並行して行われるため、他の潜在的なアッセイに対応するために、より多くの部分（例えば5-8）に切断することができる。しかし、コアが再現可能なサイズにカットすることができる作品の数は、異なるサイズのcorersを使用して変更することができるコア、の実際のサイズに依存します。オプションで、再現可能なサイズの組織片を得るのに役立つ一つの方法は、より小さな部分にそれらを細分化促進するために前に定規を使用してコアの長さを均等にすることです。プロトコルは、自然に他のウイルスに対応するように変更することができると我々は、組織が実行可能になると、最大6日間レプリケーションをサポートできることを見出した。プロトコルは、さらにcytrokinesを含む他のウイルス発現導入遺伝子の測定に拡張することができます。以下の感染は、組織をさらに組織の組織学のさらなる改良を可能にし、それがどのようにウイルス感染10月12日に関連する免疫組織化学的方法により切片と染色用パラフィンに埋め込 ​​むことができます。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>高グルコースDMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> NorthBio株式会社</td><td> NBSF - 701 </td><td></td></tr><tr><td> Amphothericin B液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A2942 </td><td> 0.1％で使用</td></tr><tr><td> Pennicilin -ストレプトマイシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P4333 </td><td> 1％で使用</td></tr><tr><td>アラマーブルー</td><td>インビトロジェン</td><td> DAL1025 </td><td></td></tr><tr><td> D -ルシフェリンカリウム塩</td><td>分子イメージング製品</td><td> D -ルシフェリンカリウム塩1グラム</td><td> 0.22μmのフィルターで10 mg / mlのとフィルターでPBSに再懸濁し</td></tr><tr><td> MEM粉末</td><td>ギブコ</td><td> ＃41500018 </td><td>使用前に0.22μmのフィルターで2X MEMとフィルタを作るの半分提案ボリュームにしてください</td></tr><tr><td>カルボキシメチルセルロース（CMC） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C9481 </td><td>脱イオン水とオートクレーブの3％溶液を作る。粉は懸濁するためには時間がかかることに注意してください</td></tr><tr><td>クマシーブリリアントブルーR </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B7920 </td><td></td></tr><tr><td> 2ミリメートル生検パンチ</td><td> Miltex </td><td> MX - 33から31 </td><td></td></tr><tr><td>ダブルエッジプレップブレード</td><td> Personna医療</td><td> 74から0002 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光disection顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>モデルM205 FA </td><td></td></tr><tr><td> in vivoイメージングシステム（IVIS） で </td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td> IVIS ® 200シリーズ</td><td></td></tr><tr><td>組織Tearor </td><td> Biospec製品</td><td>モデル985370-395 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses

腫瘍溶解性ウイルスは、（OVS）を選択的に複製し、腫瘍細胞1を殺す新規な治療です。がんの治療薬としてHSV、レオウイルス、ワクシニアOVSを含む腫瘍溶解性、さまざまなプラットフォームの有効性を評価するいくつかの臨床試験は現在進行中2月5日です。腫瘍溶解性ウイルスの一つの重要な特徴は、それらが遺伝的に顕微鏡やバイオルミネッセンスイメージング6,7によって組織の感染を可視化することを可能にするレポーターの導入遺伝子を発現するように変更できるということです。それが成功した腫瘍溶解性ウイルス療法8の可能性を確認するために治療前に患者のex vivoでの組織を感染させる可能性があるので、これはユニークな利点を提供しています。そのためには、適切に組織の不均一性を補正し、感染9〜特に前の組織の生存率を、評価する組織をサンプリングすることが重要です。腫瘍溶解性プラットフォームでだけでなく、失敗に終わったと生産性の高い感染症を区別するために、均質化後の組織の直接滴定により表される場合には、報告の導入遺伝子を用いてウイルス複製をフォローすることも重要です。このプロトコルの目的は、これらの問題に対処するためであり、ここで1を説明します。細胞培養2の腫瘍組織の採取と準備。 GFPまたはホタルルシフェラーゼ4のいずれかを発現しているワクシニアウイルスと培養組織の代謝色素アラマーブルー（3）ex vivoでの感染を使用して組織の実行可能性の評価。蛍光顕微鏡またはin vivoイメージングシステム（IVIS）5 で使用して、導入遺伝子発現の検出。プラークアッセイによるウイルスの定量化。この包括的な方法は、組織の処理の容易さ、組織の不均一性の補正、組織の生存率の制御、および不稔感染や骨善意ウイルス複製の間に差別を含む、いくつかの利点があります。

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

腫瘍溶解性ウイルスは、癌の治療薬として期待されています。治療前に患者から得られた生体組織標本の感染力を把握する能力は、この治療的アプローチのユニークな利点です。このプロトコルは、のための組織を処理する方法について説明します。<em&gt;生体外で</em腫瘍溶解性ウイルスと、その後のウイルスの定量化と&gt;感染症。

腫瘍溶解性ウイルスと生きている組織のex vivoでの感染

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

12.6K ビュー.  Ottawa Hospital Research Institute (OHRI). 腫瘍溶解性ウイルスは、癌の治療薬として期待されています。治療前に患者から得られた生体組織標本の感染力を把握する能力は、この治療的アプローチのユニークな利点です。このプロトコルは、のための組織を処理する方法について説明します。生体外で感染症。

ビデオ: Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

遺伝子デリバリーの患者の組織及び審査のex vivoでの文化

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

医学

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

腫瘍溶解性ウイルスの前臨床評価のための研究のコットンラットの取扱い

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

ex vivoでのライブ肺転移のイメージングとその微小環境

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

ラットにおける同所性肝細胞癌の局所領域治療のための腫瘍溶解性ウイルスのTransarterial管理

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to establish human enteroid ex vivo culture systems are important to model intestinal pathophysiology and to study the particular cellular responses involved. In recent years, enteroids from mice and humans are being cultured, passaged, and banked away for future use in several laboratories across the world. This enteroid platform can be used to test the effects of various treatments and drugs and what effects are exerted on different cell types in the intestine. Here, a protocol for establishing primary stem cell-derived small intestinal enteroids derived from neonatal mice and premature human intestine is provided. Moreover, this enteroid culture system was utilized to test the effects of species-specific breast milk. Mouse breast milk can be obtained efficiently using a modified human breast pump and expressed mouse milk can then be used for further research experiments. We now demonstrate the effects of expressed mouse, human, and donor breast milk on the growth and proliferation of enteroids derived from neonatal mice or premature human small intestine.

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

This protocol describes how to establish an enteroid culture system from neonatal mouse or premature human intestine as well as an efficient method to collect milk from mice.

母乳 Enteroids の増殖を促進する: 細胞増殖のEx Vivoモデル

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. Therefore, adjuvants with both humoral and cellular immuno-stimulatory capabilities that are able to promote cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses are urgently needed. Thus, faithful monitoring of adjuvant candidates that induce cross-priming and subsequently enhance CTL generation represents a crucial step in vaccine development. In here we present an application for a method that uses SIINFEKL-specific (OT-I) T cells to monitor the cross-presentation of the model antigen ovalbumin (OVA) in vivo in the presence of different adjuvant candidates. This method represents a rapid test to select adjuvants with the best cross-priming capabilities. The proliferation of CD8+ T cells is the most valuable indication of cross-priming and it is also regarded as a correlate of adjuvant-induced cross-presentation. This feature can be evaluated in different immune organs like lymph nodes and spleen. The extent of the CTL generation can also be monitored, thereby giving insights on the nature of a local (draining lymph node mainly) or a systemic response (distant lymph nodes and/or spleen). This technique further allows multiple modifications for testing drugs that can inhibit specific cross-presentation pathways and also offers the possibility to be used in different strains of conventional and genetically modified mice. In summary, the application that we present here will be useful for vaccine laboratories in industry or academia that develop or modify chemical adjuvants for vaccine research and development.

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

We present here an application for a standard immunological technique (CFSE stained OT-I proliferation) intended to rapidly monitor adjuvant-mediated cytotoxic T lymphocyte (CTL) generation in vivo. This fast estimation of CTL capacities is useful for the development of prophylactic vaccines against intracellular pathogens as well as therapeutic cancer vaccines.

急速なIn Vivo評価補助の細胞傷害性 T リンパ球生成機能のワクチン開発のため

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Ex Vivo常温肝灌流の小さな動物モデル

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

増殖糖尿病網膜症における線合併症の体外培養モデル

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

パラフィン埋め込み組織におけるヒトおよびマウス好中球外細胞トラップの免疫蛍光標識

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...