この作品は、（FW）のグラントUL1TR000124を通じて、トランスレーショナル科学、国立衛生研究所を進めるための研究資源のための国立センター、国立センターによってサポートされていました。フェリックス＆ミルドレッド·イップ寄附教授職と（DTWWへ）バーンズファミリー基金、（MT）の賞数T90DE022734下の国立衛生研究所の歯科·頭蓋顔面研究所研究所。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

1.磁気ビーズベースのエキソソームの抽出<ol><li>ビーズを再懸濁し微小遠心管にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）バッファーの495μlの中にストレプトアビジン被覆磁性微粒子を5μlのよく混合溶液をピペットで。磁気ラックを使用して3回洗浄し、500μlのPBSでビーズを懸濁します。ラックは、サンプル微小遠心管を保持することができる収納部側の磁石のアレイである。 <ol><li>各洗浄のために、最初のチューブは1分間のラックの上に座るし、その後慎重にビーズを乱すことなく上澄み液を除去するためのピペットチップを使用してみましょう。 </li><li>側の磁石せずに定期的なラックにチューブを置きます。チューブに500μlのPBSを追加し、一緒に解決し、ビーズを混合するために、ピペットを使用しています。その後、再び溶液からビーズを分離するための磁気ラック上に戻ってチューブを置く。 </li><li> PBS aの磁化と再懸濁を介してバッファのこの削除を実行します合計3回。これは、磁性粒子の最初の洗浄を行います。 </li></ol></li><li>磁気ラックの非磁化部分に配置されたチューブを、PBS緩衝液490μlの中にビーズを再懸濁する。ビーズの混合物中に1.0 mg / mlのストック濃度でビオチン化マウス抗ヒトCD63抗体のピペットで5μL。溶液中のビーズと抗体を混合するためにピペットを使用してください。 </li><li>サンプル回転子上のビーズとビオチン化抗体混合物を用いてマイクロチューブを置きます。 5秒間傾けると1秒間5℃で振動90°で相互の回転のためのサンプル回転子のための回転子のパラメータを設定します。 RTで30分間、これらのパラメータでサンプル·ビーズ混合管を回転させます。 </li><li>共役した後、未結合抗体を除去する。 <ol><li> RTで回転の30分に続いて、5分間のバック磁気ラック内のチューブを配置します。 </li><li>マイクロピペットを用いて、液相を除去することにより、ビーズの3回の洗浄を行い、500μで洗浄、PBSのリットル。トリプル洗浄後、490カゼイン-PBSのμLとラックの磁化されていない部分に所定の位置にビーズを再懸濁します。 </li></ol></li><li>抗体コートビーズを使用したエキソソーム抽出。 <ol><li>ターゲットを絞ったサンプルIDを各チューブにラベルを付けます。マイクロ遠心チューブに血清または唾液10μlのサンプルをピペットで。数回ピペッティングしてサンプルとした磁気ビーズを混合するためにピペットを使用してください。 </li><li>ローテーター上のサンプルと抗ヒトCD63抗体ビーズを有する管を配置し、室温で2時間回転させる。ステップ1.2で説明したのと同じ回転子パラメータを使用してください。 </li><li>回転サンプルの2時間に続いて、溶液からビーズを分離するために磁化するマイクロピペットで液相を除去し、トリス塩酸緩衝液500μlでビーズを再懸濁することにより、トリプル洗浄を行う。結果として得られるビーズは今エキソソームに結合させ、電界放出および測定のための準備ができているされている。 </li></ol></li></ol> 2.電界誘起リリースNDエキソソーム量の測定<ol><li> GADPHプライマーを有する電極の初期のプレコーティング<ol><li>プラスチックウェルに個別電極の交差汚染を防ぐために電極アレイを適用する。この実験では、裸の金製の作業、カウンタ、および基準電極からなるアレイ内のそれぞれの単位電極16センサ電極アレイを使用する。 </li><li>超純蒸留水でチューブに株式試薬をピペッティングすることにより100 nMのDNAプローブ、0.3 MのKCl、および10mMのピロールの原料混合物を準備します。ボルテックスで完全に混合。 注：この研究のために選択されたDNAプローブは、エキソソーム内に存在することが知られているGAPDHを参照遺伝子に対応する。使用したプローブ配列は5&#39;-ビオチンAGGTCCACCACTGACACGTTG-3 &#39;。すべての電極上でこの混合物を使用してください。 </li><li>ピペットで各金電極の表面にモノマー-DNAプローブ混合物を60μl。作業、cは適切な範囲があることを保証するために電極を調べる液体混合物によるounter、及び基準電極。 </li><li> Electropolymerizeモノマープローブの混合物は、電極表面に周期的な方形波（CSW）電界プロファイルを適用することにより、電極表面上に導電性高分子層を作成する。この電界は9秒350 mVのを適用すると、すぐに1秒間950 mVのへの切り替えで構成されています。印加電界の100秒、合計10サイクルの電極は、この環状の方形波プロファイルを適用する。 </li><li>電極の表面から液体を除去するために蒸留水および窒素ガスで乾燥して、センサ表面を3回すすぐ。液体が適切に電極から削除されていることを確認してください。 </li></ol></li><li>エキソソーム貨物アンロード<ol><li>ビーズ - エキソソーム複雑な混合物の495μLにロード検出プローブの1μMの5μlのと混合するピペットを使用しています。 注記：検出プローブは、3 &#39;末端にフルオレセイン分子に結合DNAプライマー配列である。検出器PROBこの研究のために使用される電子シーケンスはエキソソーム内にあるGAPDH mRNAに対応している。フルオレセイン結合検出プローブの配列は以下のとおりである：5&#39;-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-フルオレセイン-3 &#39;。 </li><li>ピペットの下に磁石アレイと金電極表面へのプローブとビーズ - エキソソーム複雑な混合物60μlの。この磁石アレイは、センサの作用電極に対応するように整列16 2.54ミリメートルの直径のネオジム磁石で構成されています。 図2（a）は、磁石とビーズエキソソームソリューションの配置を示している。 </li><li>サンプルは電極表面にロードされると、-300 Mvで9秒、200 MV（200秒の合計）で1秒でCSW電界の20サイクルを適用します。解放されるエキソソーム貨物は電極の表面にプライマーにハイブリダイズするであろう。エキソソームの表面マーカーは、調査の対象である場合、実験のこの部分をスキップする。 図2Bは、このプロセスを示している。 </li> &lt;李&gt;ウォッシュオフ三重蒸留水で電極表面を洗浄することにより、電極表面に結合していない分析物。窒素ガスで電極を乾燥させる。 </li></ol></li><li>レポーター抗体および読み出し<ol><li> （：1,000希釈1にHRP）カゼイン/ PBSで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに結合し150単位/ mlの抗フルオレセイン抗体60μlのを追加します。 </li><li>プローブサンドイッチに複雑な抗フルオレセインHRPに電界駆動型共役を使用してください。電極表面に5サイクルのために1秒1秒、500 mVのために-200 mVのを適用します。 図2（a）は、タンパク質および核酸システムの両方のための捕捉および検出プローブ複合体を示しています。 </li><li>蒸留水と窒素ガスとの乾燥を使用してトリプル洗浄センサー表面。 </li><li>未結合の過剰抗フルオレセイン抗体の洗浄除去に続いて、3,3 &#39;、5,5&#39;-テトラメチルベンジジン（TMB）基質の60μlを添加する。マルチチャンネルピペットを使用して、各センサー表面上に、この基板をロードします。 </li><li> 16チャネルの同時測定が可能な電気化学ポテンショスタットを用いて60秒間-200 Mvで電極電流を測定することにより、現在の電流測定読み出しを実行します。 図2Cは、読み出し時の電流プロファイルの一例である。 </li></ol></li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig2highres.jpg" /> EFIRM法の図2のコンポーネント。（A）抗ヒトCD63被覆した磁性微粒子を使用して、生体液からエキソソームを抽出した後、粒子-エキソソーム複雑に適用される周期的な方形波を用いたエキソソーム貨物をアンロードする方法。解放エキソソームからRNA / DNA /タンパク質標的を検出するために使用される電極バイオセンサーの（B）のスキーム。 （C）より大きい電流の大きさをtに対応EFIRM法、電流測定からの読み出しの代表例生体分子のより高いレベルoをこの図は、Wei らからである。14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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	<li>Rabinowits, G., Ger&#231;el-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+MicroRNA:+A+Diagnostic+Marker+for+Lung+Cancer.">Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer.</a> Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Lau, C. S., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Cancer+Exosome-like+Microvesicles+and+Salivary+Gland+Cells+Interplay+Alters+Salivary+Gland+Cell-Derived+Exosome-like+Microvesicles+In.">Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In.</a> Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037 (2012).</li><li>Bala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+exosomes+indicate+hepatocyte+injury+and+inflammation+in+alcoholic,+drug-induced,+and+inflammatory+liver+diseases.">Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases.</a> Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).</li><li>Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+exosomes:+A+reservoir+for+biomarker+discovery+and+potential+mediators+of+intrarenal+signalling.">Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling.</a> Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).</li><li>L&#228;sser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+saliva,+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA:+uptake+by+macrophages.">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9 (2011).</li><li>Palanisamy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes.">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5 (1), e8577 (2010).</li><li>Camussi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li><li>Lau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+pancreatic+cancer-derived+exosomes+in+salivary+biomarker+development.">Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Exosomes+from+Cell+Culture+Supernatants+and+Biological+Fluids.">Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).</li><li>Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+in+Saliva.">Characterization of RNA in Saliva.</a> Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).</li><li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio/Abiotic+Interface+Constructed+from+Nanoscale+DNA+Dendrimer+and+Conducting+Polymer+for+Ultrasensitive+Biomolecular+Diagnosis.">Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis.</a> Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).</li><li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Sensor+for+Multiplex+Biomarkers+Detection.">Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection.</a> Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).</li><li>Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+exosomal+biomarker+by+electric+field-induced+release+and+measurement+(EFIRM).">Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM).</a> Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).</li></ol>

デビッド·ウォンはRNAmeTRIX社、分子診断会社の共同創設者である。 PeriRx LLCはRNAmeTRIXから分子診断に関連する知的財産のサブライセンス。デビッド·ウォンはPeriRxにコンサルタントです。

結果が示すように、抗ヒトCD63被覆した磁性ナノ粒子は、具体的には70〜100ナノメートルの範囲のサイズを有する小さな粒子を捕捉することができる。この捕獲粒子は、エキソソームの以前に観察されたプロファイルと一致している。さらに、粒子の捕捉以下の低電圧CSWの使用は、ビーズ表面から削除し、貨物放出のための伝統的な溶解緩衝液ベースの方法と類似のDNAの分解プロフィールを引?...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>. The disclosures were updated.

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Errata: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

エキソソーム研究は、RNA 1、DNA 2、およびタンパク質3貨物を運ぶ脂質微小胞を調べ、調査の新興分野である。エキソソーム生物学の以前の研究は、血液4、尿5、母乳6、および唾液7などの生体液中のエキソソームの同定につながった。研究では、遠隔体8の異なるシステム間の通信を瞑想、エキソソームは、異なる細胞経路に役割を果たすことが実証されている。ロールのエキソソームは細胞間コミュニケーションにおいて役割を果たすので、それらは疾患状態と相関して生体分子標的（タンパク質、RNA、およびDNA）をパッケージ化することができると仮定される。 インビトロ 3および動物モデル9の研究は、この仮説を裏付けるように見える。バイオマーカー発見のためのエキソソームコンテンツを調査において、それは生体液から選択エキソソームを単離するための方法論を開発することが必要である、誘起expulsiエキソソームからの貨物、およびエキソソーム生体分子の定量化の上で。この作業の範囲では、エキソソームは、構造体は、約70~100ナノメートルの直径を有し、表面マーカーCD63を有するとして定義される。 研究者は、通常、最初の超遠心分離10によってエキソソームを精製した後、溶解バッファーキットの使用を通じてエキソソームコンテンツを処理する。溶解緩衝液法の使用は、数分から時間の範囲のインキュベーション時間を必要とする。このプロセスは、潜在的にエキソソーム貨物を害する劣化をサンプリングする可能性がある。例えば、周囲の細胞外環境への溶解緩衝液を介して放出唾液エキソソームRNAは、エキソソームRNA溶解後の測定が安定化試薬11を添加せずに、特に困難な作業バッファ作る、1分間の下での半減期を有している。溶解および安定化のための様々な試薬を加えるの配合効果が複雑にエージェントを導入し、ANALYを妨害する可能性がエキソソームコンテンツのSIS。別のアプローチは、迅速にエキソソームコンテンツをアンロードし、安全に特徴づけのために貨物を保持するのに役立つことができる。 本研究では、エキソソーム内容物の放出のために不均一な電界の使用を提案する。電気フィールドが分​​極し、細胞膜を構成する脂質二重層を破壊する能力を運ぶことが知られている。私たちの実験的な作品は、エキソソームの微小胞の構造を破壊し、運ば貨物を解放するために、不均一な周期的な方形波（CSW）の使用方法を探ります。この方法は、ほとんどの生体分子が中断されないことを意味し、数百ミリボルトの範囲で電圧を使用しています。我々は、環状方形波の使用は、周囲の流体環境に唾液エキソソームのmRNA内容物の放出を作動することができることを実証する。エキソソームコンテンツのこのリリースは、シームレスに、バイオマーカーの発現レベルを定量するために使用することができ、電極システムに統合されている12,13。この提案された方法は、エキソソームコンテンツの迅速、高感度、および溶解バッファー無料で分析することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig1highres.jpg" /> EFIRMワークフロー図1.概要。。EFIRM法が広くエキソソームを精製し、分析するために必要な三つの主要段階に分けられる。 このCSWベースエキソソームコンテンツ放出および分析方法は、エキソソームを単離するためのCD63特異的磁気ビーズと組み合わせて使用​​される。これらのCD63-親和性ビーズは、唾液サンプル（および他の生体液）からのエキソソームの選択的な単離を可能に。インキュベーションおよび磁化ビーズを使用してエキソソームの抽出に続いて、ビーズは、 図1を参照 。内容物の放出実験の分析部をベースCSWための電気化学センサーシステムに移行作業の概要を示しているEFIRM方法のフローチャート。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:132px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Genefluidics, USA</td>
			<td style="width:132px;">&#160;RS-1000-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips</td>
			<td style="width:157px;">Genefluidics, USA</td>
			<td>SC1000-16X-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Biotinylated anti-human CD63 Antibody</td>
			<td style="width:157px;">Ancell, USA</td>
			<td style="width:132px;">215-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Neodynium Magnetics ( 1/10&#34; dia. x 1/32&#34; thick)</td>
			<td style="width:157px;">K&#38;J Magnetics, USA</td>
			<td>DH101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Ultrapure Distilled Water</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies, USA</td>
			<td>10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Mettler Toldeo 3M KcL Solution</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific, USA</td>
			<td>1911512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Pyrrole</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:132px;">W338605-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td>
			<td style="width:157px;">Roche, Germany</td>
			<td>11426346910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:347px;">3, 3&#8242;, 5, 5&#8242; tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Neogen, Usa</td>
			<td style="width:132px;">330175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline Solution</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies, USA</td>
			<td align="right" style="width:132px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Casein/PBS</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific, USA</td>
			<td>37532</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (efirm)

エキソソームは、細胞間コミュニケーションにおける仲介の役割を果たして微小胞構造体である。彼らは病気差別バイオマーカーを運ぶかどうかを決定するエキソソームの内部の貨物を研究するために重要である。エキソソーム分析を行うためには、内部コンテンツに損傷を与えることなく、標的生体液からエキソソームを抽出し、分析するための方法を開発する必要がある。 電界誘起放出および測定（EFIRM）は、特に、生体液からのエキソソームを抽出し、その積荷を降ろして、その内部RNA /タンパク質含有量を試験するための方法である。抗ヒトCD63特異的抗体磁性微粒子を用いて、エキソソームは、まず生体液から沈殿させる。抽出後、低電圧電気サイクリック方形波（CSW）は、小胞膜を破壊し、貨物搬出を引き起こすために適用される。エキソソームの内容は、資格でのために電極表面上に固定化されたDNAプライマーまたは抗体とハイブリダイズさせる分子コンテンツのntification。 EFIRM方法は、エキソソームを抽出し、溶解緩衝液なしの分析のために貨物をアンロードするために有利である。この方法は、エキソソームの両方のRNA及びタンパク質バイオマーカー標的の特異的な検出を行うことができる。サイズベースの技術とは対照的にEFIRMは、具体的には、それらの表面マーカーに基づいて、エキソソームを抽出する。 透過型電子顕微鏡（TEM）およびアッセイは、エキソソームキャプチャおよび分析のための方法の機能性を実証する。 EFIRM法は、生理食塩水コントロールを受けた11匹のマウスに対して彼らエキソソームプロファイルをテストするために、ヒト肺癌H640細胞を注射した9匹のマウス（エキソソームマーカー、ヒトCD63-GFPを発現するようにトランスフェクト細胞株）の分析をエキソソームに適用した。エキソソームのバイオマーカーのレベルの上昇（参照遺伝子GAPDHおよびタンパク質表面マーカーのヒトCD63-GFP）は、H640の両方の血清および唾液サンプルをマウスに注射するために見出された。さらに、SalIでvaの血清試料を、直線性（R = 0.79）を有することが実証された。これらの結果は、遠位疾患の検出のための唾液エキソソームのバイオマーカーの生存のために示唆している。

TEMを用いてビーズのエキソソームキャプチャの検証 抗ヒトCD63磁気ビーズを使用して、唾液からのエキソソームの単離は、透過型電子顕微鏡（TEM）画像を用いて抽出プロトコールに従って検証した。 TEMはすぐに、（ 図3A、および3B参照 ）は、隣接するエキソソームの既知のプロファイルと一致して70〜100 nmの顆粒とした磁気ビーズを...

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Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

電界誘起リリースおよび測定によるエキソソームのバイオマーカーの検出（EFIRM）

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

detection-exosomal-biomarker-electric-field-induced-release

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

18.3K ビュー.  University of California, Los Angeles. Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves. 

ビデオ: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

アコースティック膜の微粒子技術を使用してカスタムチャイニーズハムスター卵巣-宿主細胞タンパク質のアッセイを開発する

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

生物工学

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

組織の表面張力測定ごとの集計凝集力の測定

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is subject to chemical and mechanical signals, and the mechanisms by which it senses and responds to mechanical signals are poorly understood. Elucidating the role of forces in cell maturation will enable the design of scaffolds that can promote cell adhesion and cytoskeletal coupling to the substrate, and therefore improve the capacity of different neuronal types to regenerate after injury.
Here, we describe a method to apply simultaneous force spectroscopy measurements during laser induced cell lesion. We measure tension release in the partially lesioned axon by simultaneous interferometric tracking of an optically trapped probe adhered to the membrane of the axon. Our experimental protocol detects the tension release with piconewton sensitivity, and the dynamic of the tension release at millisecond time resolution. Therefore, it offers a high-resolution method to study how the mechanical coupling between cells and substrates can be modulated by pharmacological treatment and/or by distinct mechanical properties of the substrate.

We measured the tension release in an axon that was partially lesioned with a laser dissector by simultaneous force spectroscopy measurement performed on an optically-trapped probe adhered to the membrane of the axon. The developed experimental protocol evaluates the axon adhesion to the culture substrate.

ピコニュートンとミリ秒の分解能で基板への軸索の接着性を評価するために、レーザー誘起軸索病変の間にテンションリリースの測定

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

を光学的に検出<em&gt; E.大腸菌の</emメソポーラスケイ素バイオセンサーによる&gt;バクテリア

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

透過性に骨格筋線維によって生成される最大等尺性力の測定

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell culture system that was used for a long-term cell differentiation study using microscopy. The microfluidic system consists of the following major components: an optically transparent electrotactic chip, a transparent indium-tin-oxide (ITO) heater, a culture media-filling pump, an electrical power supply, a high-frequency power amplifier, an EF multiplexer, a programmable X-Y-Z motorized stage, and an inverted phase-contrast microscope equipped with a digital camera. The microfluidic system is beneficial in simplifying the overall experimental setup and, in turn, the reagent and sample consumption. This work involves the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) induced by direct current (DC) pulse stimulation. In the stem cell maintenance medium, the mouse NPCs (mNPCs) differentiated into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes after the DC pulse stimulation. The results suggest that simple DC pulse treatment could control the fate of mNPCs and could be used to develop therapeutic strategies for nervous system disorders. The system can be used for cell culture in multiple channels, for long-term EF stimulation, for cell morphological observation, and for automatic time-lapse image acquisition. This microfluidic system not only shortens the required experimental time, but also increases the accuracy of control on the microenvironment.

In this study, we present a protocol for the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) solely induced by direct current (DC) pulse stimulation in a microfluidic system.

マイクロ流体デバイスにおける電界誘発神経前駆細胞分化

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

細胞電微小環境の有限元素モデリング

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

生体組織の刺激のための電界・磁場装置

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.