Name: an in vitro dormancy model of estrogen-sensitive breast cancer in the bone marrow: a tool for molecular mechanism studies and hypothesis generation
Uploaded: 2015-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
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1.クローン原性アッセイ<ol><li>以下の手順を使用して、エストロゲン依存性乳癌細胞株MCF-7およびT47D細胞の単一細胞懸濁液を調製<ol><li> MCF-7またはT-47D細胞との50％を超えるコンフルエントでない10cmの組織培養皿から培地（DMEM / 10％熱不活性化ウシ胎児血清/グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシン）を吸引除去します。 PBSですすいでください。 1-4分間37℃で、DMEM高グルコースに溶解し、トリプシン0.25％/ 2.21 mMのEDTAでインキュベートします。 </li><li>単一細胞分布を確実にするために位相差顕微鏡下で1分間隔で細胞をチェック。ほぼ不変の、単一細胞の状態を達成するために、細胞 - 細胞接触を破壊するには、下に数回ピペッティングにより2mLのピペットで細胞を再懸濁します。 </li><li>あなたは、インキュベーションのわずか2分後の細胞の塊を観察場合、最大4分間37℃でトリプシンで細胞をインキュベートし続けています。彼らは電子に付着し残っている場合は、クローン原性研究のためにこれらの細胞を使用しないでくださいエラーがコロニー数の収率で導入されるため、トリプシン処理の4分後に他のACH。 注：細胞が凝集している場合は、形成されたコロニーの数をインキュベート数よりも少ない数の細胞の産物を反映します。細胞が過剰にトリプシン処理された場合、それらのクローン原性ポテンシャルが減少することができます。 </li><li>のために必要なボリューム全体を含むものマスターチューブ中連続希釈により、（細胞型または継代数に応じて、+ 500細胞/ ml）を24ウェルプレート、以下/ mlの培養培地1,500細胞の単一細胞懸濁液を調製します実験におけるすべての変数。 注：目標は800セル/ cm 2（約500〜1100個/ cm 2の範囲）の最終細胞密度です。目標は、比較的容易に計数を可能にする約100 + 50個のコロニーを得るためにある混雑を防止し、コロニーを実験perturbaによって増減したときに有意な統計的差異をもたらすのに十分なコロニーを可能にしますン。 </li></ol></li><li>以下の手順を使用してクローン形成密度で細胞をインキュベート<ol><li> 1,500細胞/ mlのマスター単一細胞懸濁液管から/ウェル1,500細胞のクローン原性密度で24ウェルのフィブロネクチンコーティングプレート上の四重のウェル中の細胞をインキュベートします。 3ミリリットルを描画し、2つのウェルのそれぞれ1 mlの培地を分配することによって、5ミリリットルピペットで細胞を含む培地を粉砕します。 注：フィブロネクチンでコーティングされたプレートは、商用ベンダーから予備被覆を購入する必要があります。制御品質の外側コーティングプレートは、凹凸面での自動化されたプロセスの結果は、このアッセイのために適さありません。 </li><li>細胞懸濁液の3ミリリットルを策定し、各1mlで2井戸を埋める、ピペッティングにより、5mlのピペットでダウンサスを混ぜます。 1ピペットから任意の時点でわずか2井戸を埋めます。上下にピペッティングして、再度、マスターチューブに細胞懸濁液にピペットで再懸濁細胞を、残りのボリュームを戻し、別の2 WELを埋めるために、別の3ミリリットルを描きます各1mlとLS。 注：細胞が連続的に沈殿しますので、マスター·チューブの連続的な混合が必要です。唯一の2つのウェルを満たすのに十分な量を描画すると、細胞は同様に、ピペットに沈降するので各ウェルに類似した細胞数を追加する必要があります。 </li><li>可能細胞は、それらのクローン原性の可能性（未発表の観察）を変調する室温とCO 2濃度の懸濁液中に座っているため、細胞を大量に配布するために、急速に働きます。 </li><li>コロニーアッセイのためのウェルにそれらをピペッティングの行為の間に細胞の空間分布を最適化します。ゆっくりウェルの中央に最終細胞濃度を含有する懸濁液をピペットで行ってください。細胞が底に沈殿する前に運動を促進するために、プレートを与えないでください。円形の混合が効果的によく6日目に高い細胞密度と無数のコンフルエントコロニーを作るの周囲に細胞を遠心分離しますので、プレートを旋回しないでください。 注：これは、懸濁液中の細胞でボリュームを導入した後、全く混合よりも少ないことが望ましいので、必要な場合以外は混ぜないでください。それは、細胞を混合する必要がある場合、それは平らな表面上に静止しながら垂直方向に前後にプレートを移動させることによってこれを行います。 </li><li> 6日間のメディアを変更せずに、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。 6日後のウェル中の細胞の小さな数を大幅に栄養またはサイトカイン組成も元の培地のpHには影響しません。 </li><li>以下のようにアッセイの時間経過を設計します。1ミリリットル新鮮な培地、または新鮮な培地を含有してメディアを既存の置き換え1日目フィブロネクチンコーティングされた基層上で細胞をインキュベートし、FGF-2、以下のように6日目に0日ステイン細胞に10 ng / mlで1.4で）。 ）1.3で、以下のように、3日目に任意の実験的摂動を行っています。 </li></ol></li><li>分子シグナリングまたは接着分子の実験的摂動を設定<ol><li> 3日目に、100を追加します56;ウェルに1mLの培地に摂動剤の意図された最終濃度の10倍を含有する溶液のリットル。混在させないでください。さらに3日間37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートし続けます。 注：摂動剤は休止状態を支える役割を果たし得る阻害剤および接着分子、受容体または他の表面タンパク質、細胞内シグナル伝達経路の阻害剤、分子、因子、補因子または構造タンパク質のブロッキング剤の多様を含むことができます。 </li><li>以下のように、6日目のコロニーを染色します。 </li></ol></li><li>ステインコロニー<ol><li> 2％のエタノール/ 10mMのホウ酸ナトリウム（pHは9.0）溶液中で新たに作製した0.1％クリスタルバイオレットで培養中の6日後に染色細胞。吸引メディア、20分間各ウェルに1つmLのクリスタルバイオレット溶液を加えます。 </li><li>ウェル開口部が連続してタップを実行あふれるアイスバケツに鋭角に下にして、それらを浸漬することにより、プレートを洗浄シンク内の水。 、一度水中水平角にプレートを傾けよくダウン開いて、[1穏やかな流れる動きで除去する際に鋭角に倒します。 </li><li>ウェルの底に水がもはや青色でなくなるまで浸漬を2〜3回繰り返します。激しい洗浄はカウントとデータの誤りを大幅追加して、原因の実験的介入にあまり付着している細胞またはコロニーを除去することができます。 </li><li>それらに対応するラベルされたカバーに隣接する作業台の上にタオルの上に逆さにそれらを配置することで、一晩乾燥したプレート。 </li></ol></li><li>コロニーをカウント<ol><li>インキュベーション、染色、乾燥の6日後に各ウェルの成長と休眠コロニーの数を数えます。倒立位相差顕微鏡で40倍の倍率で最適にコロニーを数えます。増殖する細胞に比べて非常に大きいサイズの形態学的外観で、成長している12以下の細胞のコロニーとして&gt; 30細胞のコロニーをカウントし、大EXPA図1 7,15に示す割合を、核に大きな細胞質と細胞質nded。 注：彼らは簡単休眠アッセイにおいて非常に頻繁ではないとして13-29細胞のクラスターが正常にカウントされません。摂動が成長しているか、休止状態の細胞のいずれかの成長の可能性をシフトなら、彼らをカウントすることができます。これらの結果は、生物学的に有意に相関することが必要になります。 </li></ol></li></ol>免疫蛍光研究のための2クローン原性インキュベーション<ol><li>細胞数/ 24ウェル実験に類似した表面積に対応するために、6ウェルプレート中/ウェル約7,500-8,000細胞に細胞数を調整します。 </li><li>細胞の添加の前にイメージング研究のための6ウェルプレートの各ウェルベースにラウンド、滅菌、フィブロネクチンでコーティングされたカバースリップを置きます。 1.2で上記のクローン原性実験のために説明したように、各ウェルに3ミリリットルの容量でピペットで細胞を概説濃度で一度に2つのウェル）。 </li><li>細胞をインキュベート上記のように1.2.4と1.2.5で6日間。 1.3にコロニーアッセイ手順で説明したように）、300μlの量の10倍の濃度で、3日目に摂動要因を追加します。 </li><li>例えば、インテグリンα4、α5、α6、β1、β3、例えば、焦点接着複雑な分子FAK、パキシリンおよびビンキュリンのように接着分子を細胞に対する抗体で6日目の染色細胞は、このようなαチューブリンなどの運動性に関与するタンパク質、例えば、リン酸化Akt、ホスホERK、ホスホ-p38、ホスホJNK、例えば、または休眠におけるその役割のための調査の対象は、直接的または間接的のための標準的な技術を用いて、任意の他のタンパク質などのシグナル伝達経路のメンバー免疫蛍光染色。 <ol><li> -20℃で1：アセトン/メタノール1鉗子6日修正でスライドを削除します 20分、空気乾燥のためにCを°。代替の固定剤、必要に応じてパラホルムアルデヒドのような、使用されてもよいです。 2分間fの0.1％トリトンX-100、0.1％クエン酸ナトリウムと透過化細胞又は細胞内抗原の検出。 PBSで細胞を洗浄します。 </li><li>間接immunofluorecence染色、5％BSAを用いて室温で1時間または二次抗体が生成された種からの10％の免疫前血清でブロックスライドについて。 </li><li>経路メンバーまたはPBSにメーカーが推奨する特定の希釈液に希釈した休眠におけるその役割のための調査の対象である任意の他のタンパク質のシグナル伝達、接着分子、焦点複雑な分子をセルに一次抗体と4℃で一晩インキュベートし、0.1％TRITON X -100。 </li><li> PBSで3回洗浄します。 2時間室温で蛍光体結合抗体でカバースリップをインキュベートします。一例として、アレクサフルオロ488ロバ抗マウスIgG抗体は、マウスモノクローナル一次抗体を検出することができます。マウントにはDAPIで退色防止剤を用いてガラススライド上に細胞側を下カバースリップ。マニキュアで周囲をシール。 </li><li>直接免疫蛍光のために、BSAを行います）2.4.2に上記のようにブロックし、4℃で一晩蛍光体共役一次抗体とインキュベートします。 PBSで3回洗浄します。退色防止剤およびDAPIでスライドをインキュベートし、マニキュア液で密封します。 </li><li> 4でのアルミ箔とストアとカバースライドトレイ イメージングおよび写真撮影のためのC°いつまで数週間後に。 1,000倍の倍率でカメラを搭載した任意の蛍光顕微鏡イメージングシステムを使用して表示および写真の細胞。 </li><li>繊維状アクチン染色のために、1％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックスライド30分間、20分間、室温でBODIPY FL-ファラシジン（緑色）又はローダミンファロイジン（赤）でインキュベートします。退色防止剤を添加し、上記のように密封します。 </li></ol></li></ol>分子研究のための3クローン原性インキュベーション<ol><li>ウェスタンブロット<ol><li> fibronecに20,000細胞/ 60ミリメートルプレートおよび50,000細胞/ 100ミリメートルプレートのクローン原性密度でER +乳癌細胞MCF-7またはT47Dをインキュベート錫被覆された5％CO 2中37℃でプレート。 </li><li>溶解物からのタンパク質のためのmgの量を必要とする分子研究のために75,000細胞/ 100ミリメートルプレートのわずかに高い密度で細胞をインキュベートします。ウェスタンブロットを用いた分子の研究のために、またはノーザンブロットのためのRNA単離のために十分なタンパク質を収集するために実験点につき10プレートまで使用。 </li><li>ゲルローディングベースの細胞数は、非常に異なるサイズの成長と休眠細胞におけるタンパク質の発現を比較するために必要な付属物です。トリプシン処理により細胞を回収し、代わりに単一のエッジのブレードを用いて細胞を掻きのウェスタンブロットのための溶解液を調製するために、0.2％トリパンブルーで、血球計数器で一定量をカウントします。 </li><li> 2分間10,000×gで遠心分離し細胞を、吸引により培地を除去し、200μlの溶解緩衝液を追加し、溶解緩衝液中で細胞を超音波処理し、タンパク質濃度を決定します。 </li><li>細胞数によるタンパク質収量を分割することにより、細胞あたりのタンパク質の量を計算しますそれは、その発生量。タンパク質のa）の当量と同等の細胞数を表すb）のタンパク質の量の両方を表す別々のポリアクリルアミドゲルの各ウェルに溶解液をロードします。少なくとも25μgタンパク質を各ウェルにロードする必要があります。 注：これは、サイズおよびタンパク質含有量（ 図1）において著しく異なる成長および休眠細胞間の比較を可能にします。 </li></ol></li><li>フローサイトメトリー<ol><li> 3.1のように、トリプシン処理により100ミリメートルプレートからの細胞を収集し、標準的な蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって分析すると、2.4で概説されるように、細胞内または細胞外のいずれかの抗原に対する一次または二次免疫蛍光染色を使用してプロトコル。 注：抗体標識によって決定されるようにトリプシン処理により組織培養プレートから細胞を剥離すると、膜タンパク質の濃度に影響を与えません。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Braun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratin-positive+cells+in+the+bone+marrow+and+survival+of+patients+with+stage+I,+II,+or+III+breast+cancer.">Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer.</a> N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).</li><li>Benoy, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+microvessel+area+of+the+primary+tumour,+and+not+lymph+node+status,+predicts+the+presence+of+bone+marrow+micrometastases+detected+by+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+in+patients+with+clinically+non-metastatic+breast+cancer.">Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer.</a> Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).</li><li>Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inverse+relationship+between+microvessel+counts+and+tumor+volume+in+breast+cancer.">The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer.</a> Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).</li><li>Wyckoff, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+step+in+metastasis:+in+vivo+analysis+of+intravasation+at+the+primary+tumor.">A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor.</a> Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).</li><li>Phadke, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+metastatic+breast+cancer+cell+trafficking+in+bone.">Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone.</a> Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).</li><li>Braun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+an+effect+of+adjuvant+chemotherapy+on+the+elimination+of+single+dormant+tumor+cells+in+bone+marrow+of+high+risk+breast+cancer+patients.">Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients.</a> J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).</li><li>Korah, R., Boots, M., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5&#946;1+promotes+survival+of+growth-arrested+breast+cancer+cells:+an+in+vitro+paradigm+for+breast+cancer+dormancy+in+bone+marrow.">Integrin &#945;5&#946;1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow.</a> Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).</li><li>Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavopiridol+blocks+integrin-mediated+survival+in+dormant+breast+cancer+cells.">Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells.</a> Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).</li><li>Braun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pooled+analysis+of+bone+marrow+micrometastasis+in+breast+cancer.">A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer.</a> N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).</li><li>Dent, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer:+clinical+features+and+patterns+of+recurrence.">Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence.</a> Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).</li><li>Kim, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dormancy+signatures+and+metastasis+in+estrogen+receptor+positive+and+negative+breast+cancer.">Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer.</a> PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).</li><li>Hanin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+invisible:+how+mathematical+models+uncover+tumor+dormancy,+reconstruct+the+natural+history+of+cancer,+and+assess+the+effects+of+treatment.">Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 734, 261-282 (2013).</li><li>Wilkie, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+mathematical+models+of+cancer-immune+interactions+in+the+context+of+tumor+dormancy.">A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 734, 201-234 (2013).</li><li>Barkan, D., Green, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+to+study+tumor+dormancy+and+the+switch+to+metastatic+growth.">An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth.</a> J Vis Exp. (54), e2914 (2011).</li><li>Barrios, J., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+FGF-2+and+intergrin+&#945;5&#946;1+signaling+mediate+GRAF-induced+RhoA+inactivation+in+a+model+of+breast+cancer+dormancy.">Dual FGF-2 and intergrin &#945;5&#946;1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy.</a> Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).</li><li>Ganapathy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+breast+cancer+metastasis+is+dependent+on+estrogen+signaling.">Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling.</a> Clin &amp; Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).</li><li>Barkan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+metastatic+outgrowth+from+single+dormant+tumor+cells+by+targeting+the+cytoskeleton.">Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton.</a> Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).</li><li>Ghajar, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perivascular+niche+regulates+breast+tumour+dormancy.">The perivascular niche regulates breast tumour dormancy.</a> Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).</li><li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inhibition+of+the+lysophosphatidic+acid+receptor+1+on+metastasis+and+metastatic+dormancy+in+breast+cancer.">Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer.</a> J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).</li><li>Almog, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+regulatory+pathways+involved+in+persistence+of+dormant+micro-tumors.">Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 734, 3-17 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+causes+growth+arrest+in+MCF-7+human+breast+cancer+cells+while+inducing+both+mitogenic+and+inhibitory+G1+events.">Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events.</a> Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).</li><li>Fenig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transforming+growth+factor+beta+in+the+growth+inhibition+of+human+breast+cancer+cells+by+basic+fibroblast+growth+factor.">Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor.</a> Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).</li><li>Fenig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+confers+growth+inhibition+and+Mitogen-activated+Protein+Kinase+activation+in+human+breast+cancer+cells.">Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).</li><li>Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+temporal+and+spatial+gene+expression+of+fibroblast+growth+factor+family+members+during+mouse+mammary+gland+development.">Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development.</a> Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).</li><li>Plath, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+localization+of+members+of+the+fibroblast+growth+factor+family+in+the+bovine+mammary+gland.">Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland.</a> J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).</li><li>Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+evidence+of+basic+fibroblast+growth+factor+action+in+mouse+mammary+gland+development.">In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development.</a> FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).</li><li>Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+localization+of+growth+factors+during+mammary+gland+development.">Expression and localization of growth factors during mammary gland development.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 480, 19-27 (2000).</li><li>Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+FGF-2+promotes+differentiation+in+T47-D+breast+cancer+cells.">Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells.</a> Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).</li><li>Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-ordinate+loss+of+FGF-2+and+laminin+5+expression+during+neoplastic+progression+of+mammary+duct+epithelium.">Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium.</a> Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).</li><li>Wieder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+basic+fibroblast+growth+factor+in+MCF-7+human+breast+cancer+cells:+lack+of+correlation+between+inhibition+of+cell+growth+and+MAP+kinase+activation.">Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation.</a> J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).</li><li>Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+release+of+basic+fibroblast+growth+factor+from+human+bone+marrow+cultures+as+a+biologically+active+complex+with+a+phosphatidylinositol-anchored+heparan+sulfate+proteoglycan.">Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan.</a> J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).</li><li>Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+stimulates+myelopoiesis+in+long-term+human+bone+marrow+cultures.">Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures.</a> Blood. 77 (5), 954-960 (1991).</li><li>Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblast+heparan+sulfate+is+required+for+cytokine-mediated+ex+vivo+maintenance+of+human+long-term+culture-initiating+cells.">Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells.</a> Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).</li><li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesyl+transferase+inhibitor+treatment+of+breast+cancer+cells+leads+to+altered+RhoA+and+RhoC+GTPase+activity+and+induces+a+dormant+phenotype.">Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype.</a> Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).</li><li>Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+confers+a+more+differentiated+phenotype+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells.">Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells.</a> Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes &amp; Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li><li>Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+dormant+estrogen-dependent+breast+cancer+micrometastases+by+bone+marrow+stromal+injury+in+an+in+vitro+model+of+dormancy.">Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy.</a> Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , (2014).</li></ol>

がん研究02から1140-CCR-E0および癌研究のためのルースエストロンゴールドバーグ記念（RW）に国防総省助成のDAMD17-01-C-0343とDAMD17-03-1-0524、ニュージャージー州委員会でサポートされています

我々のモデルは、骨髄中の休眠のいくつかの重要な要素で構成されています。それは、フィブロネクチン、骨髄の主要構成要素、FGF-2、成長因子が豊富に骨髄間質によって合成から成り、エストロゲンの長期間10に対する骨髄における休眠残る可能性が高いタイプである敏感な細胞を、構成されてい重く骨髄31,32とそれらの相互作用は、基層と主にクローン原性密度で細胞のインキュベーションの細胞外マトリックスに堆積。骨髄微小環境は、はるかに複雑であるが、特定の機構的な質問をするために必要に応じて、この単純なシステムは、多くの追加複雑さに構築することができます。 モデルは、細胞生物学的技術、分子技術およびインビボ技術を含め、多くの方法で増殖する細胞と休止状態とを比較するために使用することができます。細胞の表現型は、再クローニング、運動することによりアッセイすることができますおよび浸潤は、非接着性腫瘍が小球の形成36または特定の遮断抗体またはペプチド7を使用して微小環境との相互作用のための機能的研究によりを開始し、35を研究しています。 クローン原性アッセイの主な出力は、細胞の成長または休止状態のクローン原性の可能性に変換する、のいずれかの成長または休止状態、コロニーの数値カウントです。上記暗示したように、多数の変数は、再現性のある結果を得るために可能な限り厳密に制御されなければならないその全てがこの結果に影響を与える可能性を有します。これらは、細胞の供給源、全体の継代数、凍結​​保存法および凍結保存した細胞培養物の品質、解凍以降の通路の数を含み、単一細胞調製物が得られた培養液の合流のソースおよび品質ウシ胎児血清、トリプシン処理およびその再現性の持続時間、持続時間室温で放置した細胞の各ウェル、器用に同等の細胞数をピペットまたは均等ウェルの全表面領域にわたって細胞を分配する器用さは、回数は板が数十人のうち、観察のためのインキュベーターから削除されます他人。一般に認められた組織培養品質コントロールを表すことに加えて、これらの変数は、実験する実験からの休眠クローン原性の可能性に影響を与えます。イントラ実験のばらつきは非常に再現性があり、実験から実験への変化率が得られたが、一般的に未満8〜10％です。通常、データの分散が増加し、システムと実験者の経験と、このアッセイを行う費やされた時間の直接的な相関関係に減少し始めます。 休眠と増殖する細胞における遺伝子発現は、RT PCR、ノーザンブロット、ウェスタンブロットによって評価することができる、免疫沈降/ウエスタンと機能的複合体の沈殿/ウェスタン、免疫蛍光法または免疫組織化学、マイクロフルイディクスによる多重化、ラマン分光法、フローサイトメトリーおよび他の技術。これらの技術は、特定の受容体、他の膜タンパク質、シグナル伝達経路、転写因子、ヒストン修飾因子、細胞小器官およびミトコンドリアタンパク質、代謝経路及びエネルギー利用、に関する無数の方法で微小環境との緊張力との相互作用の役割を決定することができます休眠の役割。 我々の以前の研究は、休止状態のクローン7の生存ならびに皮質アクチン15の上皮分布と休眠表現型の維持にPI3K経路のための重要な役割を実証しました。また、休止状態の表現型が活性化されるためにRhoAのは、具体的に、順番に抑制されなければならないことを実証しました。これは、汎阻害剤でのRhoファミリーの不活性化は休眠クローンの生存を減少させる、ここで提示されたデータとは対照的です。 T彼は、メカニズムと特定の経路を阻害または活性化するために遺伝的アプローチを使用する必要性を分析するための化学的阻害剤を使用することの危険性を強調しています。このために、方法論は、恒久的なトランスフェクションまたは形質導入によって、または一過性トランスフェクション15、siRNAまたはナノ粒子のいずれかによって、細胞の遺伝子操作に適しています。アッセイは、期間中の6日間であるため、それを一過性の遺伝子発現や干渉を測定することができる6日目に有意な表現型効果をもたらすであろう。 入力するだけでなく、休眠を出るのメカニズムを研究するためのその可能性を認識し、我々は現在、休眠から逃れるために、これらの細胞のためのメカニズムを調査しています。休眠に入ることはあまり理解されているが、休止状態からの出口を支配するメカニズムの理解はより一層理解しにくいです。私たちは、負傷した間質による炎症反応がDORの再覚醒に貢献できるという予備的観察を報告していますこのモデル37を使用してMANT MCF-7細胞。このモデルは、同様にT-47細胞に別のER +乳癌細胞株に適用することができます。 ER-細胞はFGF-2に応答して、休止状態にならないが、それは将来の研究において、異なる分化剤と他の癌細胞タイプへの方法論を適合させることが可能です。 休眠に関与する重要な機構を同定するための非常に有用な技術であるにもかかわらず、それはin vitroモデルのままです。しかしながら、休眠またはインビトロで操作を受けた細胞は、異種移植腫瘍を形成する能力について試験することができます。システムの主な潜在的な利点は、しかし、非常に複雑なインビボでの休眠モデルにおいて試験することができるという仮説の開発を可能にするメカニズムの同定です。

疾患とすぐ小さな腫瘍が血管2,3を開発する、検出可能になる前に1乳癌細胞は、骨髄に転移します。転移プロセスは迅速であるが、非効率的です。細胞を、4日目あたり数百万人で、急速に新しい血管を入力しますが、いくつかは、遠隔臓器5への旅行を生き残ります。それにもかかわらず、いくつかの微小転移は、骨に生き残るためには、新たに診断された患者1からの骨髄吸引中の単一細胞または小細胞塊として求めることができます。これらの細胞は、それら6を除去する非常に目的のために投与されるアジュバント化学療法を、抵抗します。この抵抗は、骨髄微小環境7,8との相互作用によって開始される生存シグナル伝達によって、実質的に恵まれています。微小転移は、ローカライズされた乳がんの女性の約3分の1に見られ、単変量解析9により分析すると生存の独立した指標を表現することができます。一部micrometastasesは、成長を開始しているが、再発パターンは、細胞の種類によって異なります。トリプルネガティブ乳がんの患者は、休止状態の上に不十分な制御を示唆し、1〜4年の間に再発する傾向があります。 ER / PR +細胞を含む他の細胞型は、再発10の安定した、連続的な速度で、最大20年間の休眠残ることができます。 ER +とER-乳癌細胞株および腫瘍間休眠遺伝子発現シグネチャの差が異なる休眠電位11を反映しているが、骨髄間質との相互作用は、おそらく休止状態への重要な貢献を表します。 微小転移はまれであり、10以上の6倍によって造血細胞によって劣勢されているため、生体内で休眠の研究は非常に困難です。したがって、関連するモデルはメカニズムを示唆し、in vivoで検証可能な仮説を生成することができるインビトロのデータで提供する生成する必要があります。 mathe含む休眠モデルの数、maticalモデル12,13、in vitroモデル7,8,14,15、in vivoでの異種移植モデル16、in vitroでの組み合わせと異種移植モデル17,18と自発的な腫瘍および転移モデル19は 、癌細胞の休眠20にいくつかの洞察が得られています。これらの各モデルは、独自の制限があり、それ自体の分子シグナル伝達、より生物学的に関連するモデルで試験することが休眠を支配する相互作用に関する仮説を生成するために、主に有用です。 休眠の分子機構、ER +細胞中の再発をもたらす周期停止、再分化および治療 ​​抵抗性とメカニズムをもたらす微小環境との相互作用を定義する全体的な目標では、我々は、関連する要素を選択し提供するin vitroモデルを開発しました間質微小環境7。そのコンポにいる間、比較的まばらなこのモデルは、ネントは、休眠の重要な機能に影響を与える特定の分子メカニズムを導出するための研究を可能にするのに十分に頑強です。これらの実験は、 インビボで直接試験することができる仮説を生成します。モデルは、我々は休眠中の関連であることが実証いくつかの重要な要素に依存しています。これらは、エストロゲン依存性乳癌細胞の使用は、それらの相互作用は、基体と培地の可溶性成分、フィブロネクチン基質と塩基性線維芽細胞増殖因子（FGF-2）の存在下で主にクローン原性密度で細胞の培養を含みます培地中に。 私たちは、TGFβ22を介して媒介FGF-2 21による細胞周期停止の誘導を含む、in vitroでシステムを管理するメカニズムを、特徴に依存し、上皮表現型にPI3キナーゼ7,8およびERK 8と形態形成分化を介したシグナル伝達生存RhoAの不活性化、インテグリン45;生存7,15のための間質フィブロネクチンの5β1アップレギュレーションおよびライゲーション（ 図1）。 MCF-7細胞におけるFGF-2のin vitroでの細胞周期効果は濃度では10ng / mlの21,23下記少なくとも一つのログを開始します。理論的根拠は、乳管の形態形成、哺乳類系24-27の数の巡回拡大と景気後退を支配するFGF-2の発現の時間的制御に基づいていました。我々は、FGF-2は、3D培養28における乳管形態形成を含む、分化を誘導することを実証し、そのFGF-2の発現は、一般的に、ヒト腫瘍29の悪性形質転換と共に失われています。 FGR1の発現は29を調査し、MCF-7細胞は、すべての4 FGF受容体30を発現し続ける乳癌で無傷のままでした。休眠との関連では、FGF-2は、によってエクスポートされ、頻繁にそれは造血幹細胞33の保存に機能する骨髄間質31,32上に堆積します。我々DEMFGF-2はまた、それが豊富な形態形成分化を誘導する骨髄7において、フィブロネクチン基質上で培養されたER +乳癌細胞において休眠状態を誘発することonstrated。モデルでは、乳癌細胞は、増殖阻害され、RhoGap GRAF、上皮表現型および悪性進行による再急行インテグリンα5β1lostに再分化を介してのRho Aを不活性化します。彼らは、インテグリンα5β1を介してフィブロネクチンと結合し、それが細胞毒性療法7,8,15（ 図1）に、それらが耐性をレンダリング生存シグナル伝達を活性化します。ロークラスGTPアーゼの阻害は、休止状態の表現型34を誘導することが以前に実証されています。 ここでは、モデルを確立し、ER +乳癌細胞の休眠を支配する特定の分子·細胞メカニズムを研究する研究者を可能にする具体的な手順を概説します。モデルの使用方法を説明するためにここに提示された実験において、我々は、Akt阻害剤およびPI3K阻害剤とパンのRhoとRhoファミリー（ 図1B）阻害剤とRhoキナーゼ（ROCK）阻害剤の全てのメンバーとPI3K経路（ 図1B）を対象としました。

<table><tbody><tr><td>MCF-7 cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>T47D cells&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-123</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate</td><td>Corning</td><td>354411</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes</td><td>Corning</td><td>354403</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes</td><td>Corning</td><td>354451</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin</td><td>Corning</td><td>354088</td><td></td></tr><tr><td>6 Well tissue culture plate</td><td>CellTreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder</td><td>Corning Life Sciences</td><td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum</td><td>Serum Source International</td><td>FB02-500HI</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, 100x, Liquid</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF&amp;nbsp;basic</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>234-FSE-025</td><td></td></tr><tr><td>Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)</td><td>CalBiochem</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>LY294002&amp;nbsp;</td><td>CalBiochem</td><td>19-142</td><td>Chenical PI3K inhibitor</td></tr><tr><td>C3 transferase&amp;nbsp;</td><td>Cytoskeleton</td><td>CTO3</td><td>Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>129830-28-2</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY FL-Phallacidin (green)&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>B607</td><td>Fluorochrome for fibrillar actin staining</td></tr><tr><td>BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>R415</td><td>Fluorochrome for fibrillar actin staining</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>R37114</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>P-36931</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro dormancy model of estrogen-sensitive breast cancer in the bone marrow: a tool for molecular mechanism studies and hypothesis generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

<html>実験は、アッセイを再現するために行われました。実験の時間経過は、 図2Aに示されています。細胞を1日目にクローン原性密度でインキュベートし、FGF-2、新鮮な培地中では0日目に添加し、それらを染色し、コロニーを計数したときの細胞は6日目まで培養されます。システムに何らかの摂動が所望の10倍の最終濃度で100μlの容量で3日目に投与される。 図2Bは、成長と休眠コロニーの典型的な外観を示しています。増殖するコロニーは、大規模な細胞質/核比を有する増殖している細胞よりも何倍も大きい12以下の細胞を含む。 図2Cは、四重に実施し、典型的な実験結果を示している&gt; 30細胞と休眠コロニーが含まれています。 、FGF-2の存在下で、クローンの大部分は休眠している間FGF-2を添加しない細胞の優勢な分布が成長するクローンで表されます。 &gt; 図3は、摂動剤は、3日目の図に追加された実験の一例である「ontentはパンのRho阻害剤C3トランスフェラーゼとによりGTPアーゼのRhoファミリーの阻害による休眠クローンの用量依存性阻害を表し、 Rhoキナーゼ（ROCK）阻害剤Y27632。アッセイは休眠クローンの追加阻害剤と同様に成長しているクローンのED 50を評価することができる。それが唯一の方法を説明するために提示されたので、この実験では、成長しているクローンへの影響は、決定されませんでした。 図4および図5は、アッセイは、休眠クローンの生存に対する阻害剤の組み合わせの効果を評価するために使用され得ることを実証します。我々の以前の研究では、PI3K経路が部分的に休眠クローン7の生存を阻害するPI3KおよびAktの両方のこのモデルおよび阻害における休眠細胞の持続的な活性化を受けることが実証されています。ここで、予備的観察は、Tを示し低分子量GTPaseのRhoファミリーの帽子非特異的阻害はまた、部分的に休眠クローンの生存を阻害します。 図4および図5に示されたデータは、C3トランスフェラーゼ及びROCK阻害剤Rhoファミリーの阻害と、PI3Kの阻害およびその下流のエフェクター、AKTのいずれかを組み合わせることは、ほぼ完全に、いくつかの状況において休眠クローンの生存を排除することができることを実証します。我々は以前休眠クローンは、PI3Kの阻害を存続ではなく、Aktのは、もはや表示されなく間葉と悩ん7を休止状態の表現型を示さないが、細胞から構成されていることを実証しました。 Rhoファミリーは、大きくC3トランスフェラーゼによって阻害されており、ROCK阻害剤はまた、典型的な休止状態の外観を失いfibrolastoid外観やフリル膜を想定し、また悩んで表示されている休眠クローンにおける細胞（ 図6）。これらの実験は非常にBRに照会することができるモデルを実証しますOADの方法は、治療を休止し、抵抗を支配する要素の理解を達成します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52672/52672fig1.jpg" /> 図1：メカニズムは、（A）私たちのin vitroでの休眠モデルを支配するとし、FGF2を10ng / mlの7（100X倍率）のないフィブロネクチン被覆プレート上でクローン原性密度で6日間のインキュベーション後に成長すると休眠MCF-7クローン。並列定常状態シグナリングα5β1FGFRおよびインテグリンが活性化し、休眠7を維持するために必要とされるデータを概説する（B）まとめスキーマ。 FGF-2は、シグナリングinitiatesurvival、数日後に定常状態に到達したインテグリンα5β17を 、アップレギュレートERK 8およびPI3キナーゼ7を活性化し 、G1停止21で得られたサイクリン依存性キナーゼ阻害剤をアップレギュレートします。デュアルシグナリングthrougPI3Kを介して独立してフィブロネクチンによるインテグリンα5β1のライゲーションを介して時間FGFRは、RhoAのGAP GRAF 15のFAKの活性化と膜局在化と活性化のために必要とされています。これは、RhoAの不活性化およびF-アクチン（ファロイジン染色顕微鏡写真）、上皮の再分化と休眠15の皮質再配置を許容定常状態になる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52672/52672fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52672/52672fig2.jpg" /> 図2：in vitroでの休眠アッセイの要素休眠アッセイの時間成分の（A）スキーマ。細胞は、株式会社で1,500細胞/ウェルの24ウェルプレートの最大密度で、クローン原性密度で、フィブロネクチン被覆した組織培養プレート上でインキュベートされています培地を新鮮な培地または含有する新鮮な培地で0日目に置換されている1日目に37℃でubator、5％CO 2のFGF-2を10ng / mlで細胞を再インキュベートします。染色の外観細胞は10倍の所望の濃度で100μlの容量で3日目に追加された6日目の任意の阻害剤または摂動剤に、説明したように、クリスタルバイオレット溶液で染色し、細胞を6日目（B）まで再インキュベートします成長と休眠MCF-7コロニー。成長コロニー&gt; 30細胞を含有し、休眠コロニーが12以下の細胞を含みます。休眠細胞は大きな細胞質/核比で細胞を成長させるよりもパンケーキ形の、何倍も大きいです。 （100X倍率）。 （C）のグラフは、フィブロネクチンでコーティングした24ウェルプレート上のFGF-2を10ng / mlのとせずにインキュベート1500 MCF-7ヒト乳癌細胞のクローン原性の可能性を実証します。 FGF-2がないと、細胞の優勢な分布は、一方FGF-の存在下で増殖するクローンで表され<html> 2クローンの大半は休止状態です。実験は四連で行いました。 （エラーバーはSDを+です） <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52672/52672fig3.jpg" /> 図3：パンのRhoファミリーの阻害剤C3トランスフェラーゼ及びROCK阻害剤Y27632による休眠クローンの用量依存的阻害は、T-47D細胞は、FGF-2と24ウェルのフィブロネクチン被覆プレートにウェル当たり1,000細胞のクローン原性密度で培養しました6日間の10 ng / mlで。メディア、C3トランスフェラーゼ3または5μg/ mlの、そしてROCK阻害剤Y27632 0.1、1または10 / mlのは、3日目にあったと休眠クローンは6日目のグラフを計数したがオンに染色された休眠クローンの用量依存的阻害を実証しますROCK阻害剤のそれは、このアッセイにおいて、1〜10μMであった6日目C3のED 50は、約3μgの/ mlでした。実験は四連で行いました。 （エラーバーはSDを+です） 常に &quot;&gt;：&quot; =キープtogether.withinページFO」jove_content <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52672/52672fig4.jpg" /> 図4：Akt阻害剤を伴うまたは休止状態のT-47Dクローンの生存にPI3キナーゼ阻害剤を用いたパンのRhoファミリーの阻害剤C3の複合効果 T-47D細胞はよくフィブロネクチン24にウェル当たり1,000細胞のクローン原性密度で培養しました6日間のFGF-2を10ng / mlの被覆プレート。 C3およびAKT阻害剤の併用効果は、これらに添加剤であると思われるメディア、C3トランスフェラーゼ5μg/ mlのは、Aktが、25μMの阻害剤及びLY29400220μMのは、6日目に計数した、個別に、または3日目と休眠クローンの組み合わせで追加されました濃度が、C3とPI3K阻害剤の併用効果は休眠クローンの生存の阻害に対するこれらの実験において相乗的であると思われます。実験は四連で行いました。 （エラーバーはSDを+です） <img alt<html> = &quot;図5&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52672 / 52672fig5.jpg&quot; /&gt; 図5：Akt阻害剤を伴うまたは休止状態のT-47Dクローンの生存にPI3キナーゼ阻害剤を用いたROCK阻害剤Y27632の複合効果 T-47D細胞を24ウェルのフィブロネクチン被覆プレートにウェル当たり1,000細胞のクローン原性密度で培養しました6日間のFGF-2を10ng / mlの。メディア、ROCK阻害剤Y27632 3μgの/ mlのは、Aktは、25μMおよびLY294002を阻害20μMのは3日目に、個別にまたは組み合わせて添加し、休眠クローンはY27632およびAKT阻害剤の併用効果があることが表示されません。6日目に計数しましたこれらの濃度で添加剤が、Y27632とPI3K阻害剤の併用効果は休眠クローンの生存の阻害にこれらの実験では、添加剤よりもあるように思われます。実験は四連で行いました。 （エラーバーはSDを+です） .JPG &quot;/&gt; 図6：記載されているように、C3トランスフェラーゼ及びROCK阻害剤Y27632で処理した後、休眠T-47Dクローンの生存出現コロニーアッセイは、FGF-2を1000細胞/ウェルで24ウェルのフィブロネクチンコーティングした組織培養プレート中で四重に設立された、阻害剤示された濃度で3日目に添加し、細胞を1日で染色し、写真撮影した汎Rhoファミリー阻害剤で処理された6細胞は、それらのスプレッド外観を失っ小さくなり、樹状と悩んで登場しました。 （100X倍率）。

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An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;骨髄中のエストロゲン感受性乳癌の休眠モデル：分子機構の研究と仮説生成のためのツール

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

8.2K ビュー.  Rutgers New Jersey Medical School. We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo. 

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Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

破骨細胞形成乳房癌細胞と共培養末梢血単球からの人間の前臨床モデルの開発

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

がん研究

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

アンインビトロ</em転移性増殖に腫瘍の休眠とスイッチを研究する>システム

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

医学

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

骨転移モデル

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

アン<em&gt;エクスビボ</emヒト乳癌でホルモンの作用を研究するために&gt;モデル

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

アン

要約

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破骨細胞形成乳房癌細胞と共培養末梢血単球からの人間の前臨床モデルの開発

アンインビトロシステム

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックスモデル

骨転移モデル

乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

乳がん研究のための潜在的機能インビトロモデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

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アンインビトロシステム

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

骨転移モデル

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乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

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培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックスモデル

乳がん研究のための潜在的機能インビトロモデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド