We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).

1.組織の収穫と筋組織の凍結<ol><li>イソフルラン（2-クロロ-2-（ジフルオロメトキシ）-1,1,1-トリフルオロエタン）の過剰摂取で、​​マウスを安楽死させます。ヒュームフードで、このステップを実行し、そのようなデシケーターやイソフルランに浸した綿棒を含むベルジャー等の二次封じ込めメソッドを使用します。 </li><li>しっかりとフットパッドを絞ることによって死を確認してください。このような頸椎脱臼などの安楽死の二次メソッドを使用します。 </li><li>筋肉の緩み髪の毛の付着を低減するために、70％のアルコールで毛を濡らします。このような＃5のように微細な鉗子を使用して、四肢切断、皮膚の皮をむきます。 </li><li>慎重に、下骨から（この場合は前脛骨筋（TA））、目的の筋肉を分離腱から開始して削除します。 </li><li> 、筋肉を切除10月（最適切断温度化合物）でそれをカバーし、標識された使い捨ての凍結金型の上に平らに横たわっていました。筋肉は、その正常な生理的姿勢であることを確認してください（TAIにヘッド延伸することなくL）。あるいは、小さな発泡スチロールの正方形の筋肉を凍結し、筋肉の正しい長さを確保するために昆虫ピンを使用してピン。 </li><li>液体窒素を用いた鋼ビーカーに2-メチルブタン（イソペンタン）を冷やします。 5分 - これは、平均3になります。白い沈殿物をビーカーの底と壁に形成し始めるまで、断続的に攪拌してください。 注：この場合、イソペンタン、最適な凍結温度に到達した（-150°C） </li><li>チルド2-メチルブタンの筋肉を含む金型を浸し。 12秒と腓腹筋ヒラメ筋（GS）と15上腕三頭筋などの大きな筋肉 - - 20秒かかる6ダイアフラムと長指伸筋（EDL）などの小さな筋肉をフリーズします。あまりにも長い間、この亀裂につながる可能性としてのための筋肉を凍結しないでください。 </li><li>ドライアイスの上で凍結組織を移し、（このプロセスは15の周りの平均をとることに注意してください - 20分）イソペンタンを蒸発させて。アルミ箔で組織をラップとuでそれらを格納切片までLTRA低温（-70℃〜-80℃）。 </li></ol> 2.組織ブロックを準備するために10月に組織を埋め込みます<ol><li>ドライアイス上で輸送組織が融解を防ぐためにcyrostatします。 （組織の完全融解を回避するために、C°-24、-20に設定）チャンバをクライオスタットし、それらを30分間平衡化させるために組織を転送します。 </li><li>の冷却ペルチェベイの電源を入れます。クライオスタットは、この冷却を持っていない場合は、すぐに10月を凍結するエアロゾル冷却スプレーを使用しています。このような埋め込み中の任意の時点での筋融解は、凍結損傷を与えることができないようにしてください。 </li><li>試料ディスク上の10月の均一な薄層を追加し、冷まします。上にまだ液体ながら10月のほとんどが底に凍結されている場合には、（横断面と縦断のための10月に平行のため10月に垂直な方向）正しい向きで組織を挿入します。すぐにOCTを凍結するエアロゾル冷却スプレーを使用してください。熱EXTと組織のunembeded部分に触れてractor、45秒間待ちます。 </li><li> 、筋肉の周りに10月の別の薄い層を追加し、エアロゾル冷却スプレーで噴霧し、前のステップと熱を抽出。 </li><li>少しずつで10月を追加し続けると、すぐに全体の筋肉がカバーされるまでエアロゾル冷却スプレーおよび熱抽出器の組み合わせを使用して、10月にフリーズ。 </li><li>組織ブロックの上に熱抽出を入れ、5分間待ちます。 </li></ol> 3.切片を作製し、筋肉のミッド腹領域からのセクションを識別する<ol><li>試料ヘッドの上に試料をマウントします。ディスクを右に回して、締め付けます。試料ディスクを試料ヘッドとの良好な接触状態にあることを確認します。 </li><li> °-21の間および-24℃に室内温度を調整し、設定温度が達成されるまで待ちます。 </li><li>厚さの設定（7μm）を調整します。粗微動の設定を使用してブロックを前進または後退させることにより、ブロックをトリミング。 </li><li>セクションを収集上のスライドに切断面の付着を容易にするために、反対の電荷間の引力を使用して、セクションの上にスライドの上部を押して、正に荷電した顕微鏡スライドを予熱しました。 </li><li>セクションの断面積（​​CSA）を測定することにより、ミッドベリーセクションを識別します。顕微鏡に接続されているコンピュータにこの使用してイメージングソフトウェアを実行してください。 注：ソフトウェアプログラムのトレース機能を介して位相コントラスト画像が取得され、筋肉全体の円周を測定します。これは、CSA、ならびに最小フェレット直径（粒子の反対側にある2つの平行な接線の間の最小距離として表現さ​​れる繊維断面サイズの測定）測定の両方が得られます。注：CSAと最小フェレット直径測定値がプラトーに開始すると、半ば腹に達しました。 </li><li>将来の染色のために-80℃でスライドをインベントリおよびアーカイブします。 注：10月前staininに削除する必要はありません。G手順。スライドをカバーガラスをされると、彼らはすぐに染色される準備ができています。 </li></ol> 4.染色注：詳細なステップバイステップの手順は、製品データシートに記載されていますし、染色手順のために従うべきであるが、個人の最適化は、最適な染色を得るために必要とされ得ます。 <ol><li>メディアは（表を参照）の取付は、水と混和しないので、（70％、95％、および100％エタノールに2分間ずつ）アルコールの増加グレードを通してスライドを脱水し、キシレン（5分間、100％）を確保するためにそれらをクリアスライドは、時間をかけて不透明になることはありません。 </li><li>セクションをカバースリップし、それらが乾燥してみましょう。イメージングソフトウェアを備えた顕微鏡を用いた画像。 </li></ol>

<ol>
	<li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies.">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li><li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica.">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li><li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscular+dystrophy.+I.+History,+clinical+status,+muscle+strength,+and+biopsy+findings.">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li><li>Platzer, A. C., Chase, W. 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A., Kostek, C. A., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+apoptosis+improves+outcome+in+a+model+of+congenital+muscular+dystrophy.">Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy.</a> The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).</li><li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice,+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li><li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy.">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14 (2014).</li><li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis:+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A.">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li><li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy.">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+fixation.">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li><li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections.">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li><li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+'gold+standard'+for+immunohistochemistry.">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li><li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia.">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

組織学および免疫組織化学は、様々な神経筋障害で病状の症状および進行を理解する上で重要なツールとして使用されています。古典的には、筋肉生検は、最初のホルムアルデヒドで固定し、その後パラフィンワックスで包埋しました。ホルムアルデヒド固定は、組織構造を保持し、室温で組織保存および輸送を可能にするが、それはまた、正確な免疫染色​​を達成するためのさらなるス?...

筋肉組織学の検討は、神経筋障害1-4の異なるタイプの理解に重要な役割を果たしています。他の技術と組み合わせると、それは研究者が病状の症状および進行のより良いアイデアを得ることができ、また、治療的介入5-10の有効性を評価するために不可欠であることができます。しかし、正確に、組織を直ちに切除前の生理的状態を維持するように適切な方法で保存する必要があります。これは、除去、保存、切片、および染色の際に細心の注意が必要です。 組織を光学顕微鏡研究のため、2つの異なる方法で調製する​​ことができます。 （FFPE）のセクション、埋め込 ​​まれた第1の方法、ホルマリン固定パラフィンは、組織はパラフィンワックス11,12に埋め込 ​​まれる前に、10％の自然緩衝ホルムアルデヒド中に固定することが必要です。固定工程は、より良い形態を維持するのに役立つだけでなく、クロスリンク内因性のPRoteinsは、このように免疫染色のための複雑な抗原回復手順を必要とし、このようなセクション12の酵素染色の可能性を排除します。凍結切片を、一方、予め固定または処理する必要はありません。したがって、タンパク質は、天然の生物学的な立体配座13,14を保持することができます。また、凍結切片はまた、時間に肉腫および他の外科的生検15の術中診断で、たとえば、必要である、迅速なターンアラウンドタイムを可能にします。適切に行われていない場合は、この方法は、組織学的検査のためのセクションでは、不向き作る筋肉のアーキテクチャの変更を紹介しダメージを、凍結する傾向があります。本稿では、適切な検査のために最適な染色を達成するために、筋肉生検を準備するための最も効果的な方法を概説します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica CM 1850&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 
			Richard Allen Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse 50i&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. 
			Phone: +1-631-547-8500 
			Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Nikon Imaging Software Basic Research</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. 
			Phone: +1-631-547-8500 
			Image J, Metamorph</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>14043-220-05</td>
			<td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td>
			<td>JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>4583</td>
			<td>Sakura Inc.</td>
			<td>Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA 
			Leica Microsystem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze It</td>
			<td>23-022524</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable tissue mold</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colorfrost plus slides</td>
			<td>9991001</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>650501-4L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>HC-1300-1GL</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl butane</td>
			<td>M 32631-SL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HC-7001GA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 280</td>
			<td>8311-4</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Gill #3</td>
			<td>CS402-1D</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>6766007</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis

筋肉生検の組織学的評価は、神経筋疾患の病態の発症および進行の理解に不可欠なツールを務めています。しかし、そうするためには、適切なケアは、最適な染色を達成するための組織を切除し、保存するときに注意が必要です。組織保存する一つの方法は、ホルムアルデヒドで組織を固定し、その後パラフィンワックスでそれらを埋め込むことを含みます。この方法は、よく形態を保持し、室温で長期保存を可能にしますが、面倒であり、有害な化学物質の取り扱いが必要です。また、効果的な免疫染色​​のための抗原回復プロトコルを必要と抗原架橋、ホルムアルデヒド固定をもたらします。逆に、凍結切片は、固定を必要とし、したがって、生物学的な抗原の立体構造を保持しません。この方法は、intraoperaような迅速な組織学的評価を必要とする状況で、それは特に有用なもの、時間の周りクイックターンで明確な利点を提供します外科的生検を的。ここでは、異なる組織学的および免疫学的汚れによる可視化のための筋肉生検を調製する最も効果的な方法を説明します。

収穫および組織の凍結のためのセットアップを図1に見ることができる。切除した組織を乾燥する（ 図1A）を回避するために、PBSに浸したガーゼ上に格納されるべきです。組織を組織学的分析のために使用されるように選択される場合、それらは、OCT中に浸漬し、適切な向きでクライオモールド上に配置し、正確な形態（ 図1B）を確保することができるよ...

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Do&#039;s and Don&#039;ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

組織学的分析のために筋肉凍結切片の調製でのやっていいことといけないことを行います

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

do-s-don-ts-preparation-muscle-cryosections-for-histological

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Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

31.3K ビュー.  Boston University. Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.