We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).

1. الأنسجة الحصاد وتجميد الأنسجة العضلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفأر مع جرعة زائدة من الأيزوفلورين (2-كلورو-2- (difluoromethoxy) -1،1،1-trifluoro-الإيثان). تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان واستخدام أسلوب الاحتواء الثانوي مثل مجفف أو جرة الجرس تحتوي على قطعة من القطن غارقة في الأيزوفلورين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد وفاة خلال الضغط بحزم قاطع الطريق. استخدام أسلوب الثانوية للقتل الرحيم مثل خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب الفراء مع الكحول 70٪ للحد من الخلاف من جدائل الشعر فضفاضة على العضلات. قشر الجلد قبالة الطرف باستخدام ملقط غرامة مثل # 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل بعناية عضلة الفائدة (الظنبوبي الأمامي (TA) في هذه الحالة) من العظام تحتها، بدءا من وتر وإزالتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئصال العضلات، وتغطية ذلك في أكتوبر (قطع الأمثل درجة حرارة المركبة)، ووضع عليه شقة في قالب تجميد المتاح المسمى. تأكد من أن العضلات هي في توجهاته فيزيولوجية طبيعية (الرأس إلى تايل) دون التمدد. بدلا من ذلك، تجميد العضلات على الساحات الستايروفوم صغيرة ويعلقون عليه باستخدام دبابيس الحشرات لضمان طول الصحيح للعضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هدئ 2-methylbutane (isopentane) في كوب الصلب باستخدام النيتروجين السائل. هذا يستغرق في المتوسط ​​3-5 دقيقة. الحفاظ على اثارة بشكل متقطع حتى تبدأ الرواسب البيضاء التي تشكل في القاع وجدران الكأس. ملاحظة: عند حدوث ذلك، قد وصلت isopentane الأمثل درجة حرارة التجمد (-150 درجة مئوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع القوالب التي تحتوي على عضلات في برود 2-methylbutane. تجميد العضلات الصغيرة مثل إبهام اليد الحجاب الحاجز والباسطة للأصابع (EDL) ل6-12 ثانية، والعضلات الكبيرة مثل النعلية الساق (GS) وثلاثية الرؤوس لمدة 15 - 20 ثانية. لا تجميد العضلات لفترة طويلة جدا لأن هذا قد يؤدي إلى تكسير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة المجمدة إلى الثلج الجاف، والسماح للتتبخر isopentane (لاحظ أن هذه العملية تستغرق في المتوسط ​​حوالي 15-20 دقيقة). التفاف الأنسجة في رقائق الألومنيوم وتخزينها في شltra درجة حرارة منخفضة (-70 ° C إلى -80 درجة مئوية) حتى باجتزاء. </li></ol> 2. تضمين الأنسجة في أكتوبر لإعداد كتلة الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأنسجة النقل على الجليد الجاف لcyrostat لمنع ذوبان الجليد. الأنسجة نقل إلى غرفة ناظم البرد (وضعت في -20 إلى -24 ° C لتجنب ذوبان كامل للأنسجة) والسماح لهم تتوازن لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل خليج بلتيير تبريد جرا. إذا لم يكن لديك ناظم البرد هذا التبريد، استخدم الهباء الجوي رذاذ التبريد لتجميد بسرعة أكتوبر لا تدع ذوبان العضلات في أي لحظة خلال التضمين وهذا يمكن أن يؤدي إلى تلف التجميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة طبقة رقيقة موحدة من أكتوبر على القرص العينة وندعه يبرد. عندما يتم تجميد أكثر من أكتوبر على الجزء السفلي في حين لا يزال السائل على الجزء العلوي، وإدراج الأنسجة في الاتجاه الصحيح (عمودي أكتوبر للقطاعات عرضية وبموازاة أكتوبر للالمقاطع الطولية). استخدام الهباء الجوي رذاذ التبريد لتجميد بسرعة أكتوبر تلمس الجزء unembeded من النسيج مع تحويلة الحرارةractor وانتظر لمدة 45 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة طبقة رقيقة أخرى من أكتوبر حول العضلات، ورذاذ مع الهباء الجوي رذاذ التبريد واستخراج الحرارة كما في الخطوة السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على إضافة أكتوبر بزيادات صغيرة وبسرعة تجميد أكتوبر باستخدام مزيج من الهباء الجوي رذاذ ومستخرج حرارة التبريد حتى يتم تغطية العضلات كلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مستخرج الحرارة في الجزء العلوي من كتلة الأنسجة والانتظار لمدة 5 دقائق. </li></ol> 3. إعداد إنشائية والتعرف على أقسام من منطقة منتصف البطن من العضلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل العينة على رأس العينة. تشديد مقبض الباب لتأمين القرص. تأكد من أن القرص العينة على اتصال جيد مع رئيس العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة حرارة الغرفة ما بين -21 و -24 ° C وانتظر حتى يتم تحقيق درجة الحرارة المحددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط إعدادات سمك (7 ميكرون)؛ تقليم الكتلة عن طريق دفع أو سحب كتلة باستخدام إعدادات الخشنة وغرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المقاطعفي مرحلة ما قبل تحسنت-شرائح المجهر موجبة الشحنة عن طريق الضغط على الجزء العلوي من الشريحة على الأقسام، وذلك باستخدام التجاذب بين الشحنات المتضادة لتسهيل انضمام الأقسام خفض إلى الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف على أقسام منتصف البطن عن طريق قياس مساحة المقطع العرضي (CSA) من الأقسام. القيام بذلك باستخدام برامج التصوير على الكمبيوتر متصلة المجهر. ملاحظة: يتم التقاط الصور المرحلة التباين ويتم قياس محيط العضلة بأكملها من خلال وظيفة البحث عن المفقودين على برنامج حاسوبي. هذا وسوف تسفر كل من وكالة الفضاء الكندية وكذلك الحد الأدنى قطر النمس (قياس حجم الألياف مستعرضة أن يتم التعبير عن أصغر مسافة بين اثنين من الظلال متوازية على طرفي نقيض من الجسيمات) القياسات. ملاحظة: عندما تبدأ القياسات CSA وقطر الحد الأدنى النمس إلى الهضبة، تم التوصل إلى منتصف البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جرد وأرشفة الشرائح في -80 درجة مئوية لمدة تلطيخ المستقبل. ملاحظة: أكتوبر لا تحتاج إلى إزالة قبل staininز الإجراءات. بمجرد coverslipped الشرائح، وأنهم على استعداد لتكون ملطخة على الفور. </li></ol> 4. تلطيخ ملاحظة: في حين خطوة بخطوة الإجراءات التفصيلية ويمكن الاطلاع على ورقة بيانات المنتج وينبغي اتباع إجراءات تلطيخ، قد تكون هناك حاجة الأمثل الشخصية للحصول على تلطيخ الأمثل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسبب تصاعد وسائل الإعلام (انظر الجدول) ليست غير قابلة للامتزاج مع الماء، ويذوى الشرائح من خلال درجات متزايدة من الكحول (2 دقيقة لكل منهما في 70٪، 95٪، و 100٪ من الإيثانول) واضحة لهم مع الزيلين (100٪ لمدة 5 دقائق) لضمان الشرائح لا تصبح مبهمة مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ساترة الأقسام والسماح لهم الجافة. صورة مع المجهر مجهزة برامج التصوير. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies.">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li><li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica.">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li><li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscular+dystrophy.+I.+History,+clinical+status,+muscle+strength,+and+biopsy+findings.">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li><li>Platzer, A. C., Chase, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+Alterations+in+Preclinical+Mouse+Muscular+Dystrophy.">Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy.</a> The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).</li><li>Mercuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+magnetic+resonance+imaging+involvement+in+muscular+dystrophies+with+rigidity+of+the+spine.">Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine.</a> Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).</li><li>Tasca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+molecular+signatures+in+magnetic+resonance+imaging-staged+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy+muscles.">Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles.</a> PloS one. 7, e38779 (2012).</li><li>Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+apoptosis+improves+outcome+in+a+model+of+congenital+muscular+dystrophy.">Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy.</a> The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).</li><li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice,+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li><li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy.">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14 (2014).</li><li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis:+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A.">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li><li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy.">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+fixation.">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li><li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections.">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li><li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+'gold+standard'+for+immunohistochemistry.">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li><li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia.">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وقد استخدمت الأنسجة والمناعية كأدوات رئيسية في فهم مظاهر وتطور علم الأمراض في مختلف الاضطرابات العصبية والعضلية. تقليديا، كانت ثابتة الخزعات العضلية لأول مرة في الفورمالديهايد ثم جزءا لا يتجزأ من شمع البرافين. في حين الفورمالديهايد تثبيت يحافظ على بنية الأنسجة ويس...

فحص الأنسجة العضلية يلعب دورا حاسما في فهم أنواع مختلفة من الاضطرابات العصبية والعضلية 1-4. عندما جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى، فإنه يسمح للباحثين للحصول على فكرة أفضل عن مظاهر وتطور علم الأمراض، ويمكن أيضا أن يكون أساسيا لتقييم فعالية التدخل العلاجي 10/05. ومع ذلك، لتكون دقيقة، تحتاج الأنسجة الى الحفاظ عليها بطريقة سليمة وذلك للحفاظ على الحالة الفسيولوجية على الفور قبل الختان. وهذا يتطلب عناية كبيرة خلال إزالة والحفاظ عليها وباجتزاء، وتلطيخ. الأنسجة يمكن إعداد بطريقتين مختلفتين للدراسة المجهرية الخفيفة. الطريقة الأولى، الفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من (FFPE) أقسام، يتطلب الأنسجة لتكون ثابتة في 10٪ الفورمالديهايد مخزنة الطبيعي قبل أن يتم دمجهم مع شمع البارافين 11،12. الخطوة تثبيت تساعد على الحفاظ على التشكل أفضل ولكن أيضا عبر الروابط والعلاقات العامة المحليةoteins مما يستلزم إجراءات استرجاع مستضد المعقدة لالمناعية والقضاء على إمكانية الأنزيمية تلطيخ على هذه المقاطع 12. أقسام المجمدة، من ناحية أخرى، لا تحتاج إلى أن يكون ما قبل ثابتة أو معالجتها. لذلك، البروتينات هي قادرة على الاحتفاظ التشكل البيولوجية الأم 13،14. وعلاوة على ذلك، الأبواب المجمدة تسمح أيضا للمرة تحول سريع، وهو في أوقات الضرورة، على سبيل المثال في التشخيص أثناء العملية من الأورام اللحمية وخزعات جراحية أخرى 15. ومع ذلك، إذا لم ينفذ بشكل سليم، وهذا الأسلوب هو عرضة للتجميد الضرر الذي يدخل تغييرات على بنية العضلات مما يجعل الأجزاء غير صالحة للفحص النسيجي. وهذه الورقة تحدد الأسلوب الأكثر فعالية لإعداد الخزعات العضلية من أجل تحقيق تلطيخ الأمثل للفحص الصحيح.

<table><tbody><tr><td>Cryostat</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123&lt;br /&gt;Alternative: Richard Allen Scientific</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500&lt;br /&gt;Alternative: Olympus</td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Nikon Imaging Software Basic Research</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500&lt;br /&gt;Alternatives: Image J, Metamorph</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>14043-220-05</td><td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td><td>1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.</td></tr><tr><td>OCT</td><td>4583</td><td>Sakura Inc.</td><td>Torrence, CA 90501 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Disposable tissue mold</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost plus slides</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis

وقد خدم التقييم النسيجي للخزعة العضلات كأداة لا غنى عنها في فهم تطور وتقدم من أمراض الاضطرابات العصبية والعضلية. ومع ذلك، من أجل القيام بذلك، تحتاج الرعاية المناسبة الواجب اتخاذها عند استئصال والحفاظ على الأنسجة لتحقيق تلطيخ الأمثل. أسلوب واحد من الحفاظ على الأنسجة ينطوي على تحديد الأنسجة في الفورمالديهايد ومن ثم دمجها مع شمع البارافين. هذا الأسلوب يحفظ التشكل بشكل جيد ويسمح للتخزين طويل الأجل في RT لكن هو مرهق ويتطلب التعامل مع المواد الكيميائية السامة. وعلاوة على ذلك، النتائج الفورمالديهايد التثبيت في مستضد عبر ربط، وهو ما يتطلب بروتوكولات استرجاع مستضد لالمناعية فعالة. على العكس من ذلك، لا يتطلب باجتزاء المجمدة التثبيت وبالتالي يحتفظ البيولوجي التشكل المستضد. يوفر هذا الأسلوب أيضا ميزة واضحة بدوره سريعة حول الوقت، مما يجعلها مفيدة بشكل خاص في الحالات التي تحتاج إلى تقييم النسيجي سريع مثل intraoperaموانع الخزعات الجراحية. نحن هنا وصف الأسلوب الأكثر فعالية لإعداد خزعات العضلات التصور مع مختلف البقع النسيجية والمناعية.

ويمكن رؤية مجموعة المتابعة للحصاد وتجميد الأنسجة في الشكل 1. يجب أن يتم تخزين الأنسجة رفعه على الشاش غارقة في برنامج تلفزيوني لتجنب تجفيف (الشكل 1A). عندما يتم اختيار الأنسجة ليتم استخدامها للتحليل النسيجي ينبغي أن تراجع في أكتوبر وضعت على البرد العف...

Watch this Scientific Journal Video about Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis at JoVE.com

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

ما يفعل وما يترك في إعداد العضلات Cryosections للتحليل النسيجي

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

do-s-don-ts-preparation-muscle-cryosections-for-histological

Research

JoVE Journal

Medicine

31.7K Views.  Boston University. Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Video: Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Demonstrated in this video are the techniques for flash freezing and sectioning embryonic brain tissue from mouse. Useful tips for using the cryostat are given, including troubleshooting methods that can be used while cutting to ensure that the resultant tissues sections are free of cracks and other distortions.

فلاش التجميد وCryosectioning E12.5 مخ الفأر

Biology

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

تحريض الحاد الهيكل العظمي تجديد العضلات التي Cardiotoxin حقن

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Developmental Biology

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures for rat laryngeal dissection, flash-freezing, and cryosectioning of the vocal folds. This study describes how to cryosection vocal folds in both longitudinal and cross-sectional planes. A novelty of this protocol is the laryngeal tracking during cryosectioning that ensures accurate identification of the intrinsic laryngeal muscles and reduces the chance of tissue loss. Figures demonstrate the progressive cryosectioning in both planes. Twenty-nine rat hemi-larynges were cryosectioned and tracked from the emergence of the thyroid cartilage to the appearance of the first section that included the full vocal fold. The full vocal fold was visualized for all animals in both planes. There was high variability in the distance from the appearance of the thyroid cartilage to the appearance of the full vocal fold in both planes. Weight was not correlated to depth of laryngeal landmarks, suggesting individual variability and other factors related to tissue preparation may be responsible for the high variability in the appearance of landmarks during sectioning. This study details a methodology and presents morphological data for preparing the rat vocal fold for histochemical neuromuscular investigation. Due to high individual variability, laryngeal landmarks should be closely tracked during cryosectioning to prevent oversectioning tissue and tissue loss. The use of a consistent methodology, including adequate tissue preparation and awareness of landmarks within the rat larynx, will assist with consistent results across studies and aid new researchers interested in using the rat vocal fold as a model to investigate laryngeal neuromuscular mechanisms.

This protocol describes methods used to prepare rat vocal folds for histochemical neuromuscular study.

إعداد أضعاف الصوتية الجرذ للتحليلات العصبية والعضلية

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Neuroscience

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

الفرز الأنسجة وتجميد لنماذج من الأمراض العضلات الهيكلية

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative prognostic factor for several other disorders such as cardiovascular disease and cancer. Excessive lipid infiltration decreases muscle mass and strength. It also results in lipotoxicity and insulin resistance depending on total intramyocellular lipid content, lipid droplet (LD) morphology, and subcellular distribution. Fiber type (oxidative vs glycolytic) is also important, since oxidative fibers have a greater capacity to utilize lipids. Because of their crucial implications in pathophysiology, in-depth studies on LD dynamics and function in a fiber type-specific manner are warranted.
Herein, a complete protocol is presented for the quantification of intramyocellular lipid content and analysis of LD morphology and subcellular distribution in a fiber type-specific manner. To this end, serial muscle cryosections were stained with the fluorescent dye Bodipy and antibodies against myosin heavy chain isoforms. This protocol enables the simultaneous processing of different muscles, saving time and avoiding possible artifacts and, thanks to a personalized macro created in Fiji, the automatization of LD analysis is also possible.

Increasing evidence indicates that excessive infiltration of lipids inside skeletal muscle results in lipotoxicity and diabetes. Here, we present a complete protocol, including tissue processing, staining with Bodipy, image acquisition, and analysis, to quantify the size, density, and subcellular distribution of lipid droplets in a fiber-type specific manner.

نوع الألياف والتحليل الخاص بالخلايا لمحتوى قطرات الدهون في العضلات الهيكلية

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative ...

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

عالية الإنتاجية، متعدد صورة Cryohistology من تمعدن الأنسجة

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Cryosectioning المناطق المتاخمة من العضلات الهيكلية واحدة فأرة للالتعبير الجيني والتحليلات النسيجية

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible cytoplasmic compartments. Another hurdle is the tight apposition of myofibers to the surrounding tissues. Because the process of tissue fixation and paraffin embedding leads to the shrinkage of muscle fibers, freezing is an optimal means of hardening muscle tissue for sectioning. However, a commonly encountered issue, the formation of ice crystals, occurs during the preparation of frozen sections because of the high water content of muscle. The protocol presented here first describes a simple and efficient method for properly freezing muscle tissues by immersing them in liquid nitrogen. The problem with using liquid nitrogen alone is that it causes the formation of a nitrogen gas barrier next to the tissue, which acts as an insulator and inhibits the cooling of the tissues. To avoid this "vapor blanket" effect, a new cryovial was designed to increase the speed of liquid flow around the tissue surface. This was achieved by punching a total of 14 inlet holes in the wall of the vial. According to bubble dynamics, a higher rate of liquid flow results in smaller bubbles and fewer chances to form a gas barrier. When liquid nitrogen flows into the cryovial through the inlet holes, the flow velocity around the tissue is fast enough to eliminate the gas barrier. Compared to the method of freezing muscle tissues using pre-chilled isopentane, this protocol is simpler and more efficient and can be used to freeze muscle in a throughput manner. Furthermore, this method is optimal for institutions that do not have access to isopentane, which is extremely flammable at room temperature.

This protocol describes a procedure to freeze muscle tissues by plunging them directly into liquid nitrogen. This protocol also highlights a new cryovial that can avoid the &#34;blanket effect&#34; of nitrogen gas when liquid nitrogen contacts the tissue surface of a specimen.

A متعدد حفرة Cryovial يزيل تجميد قطع أثرية عندما منغمسين الأنسجة العضلية مباشرة في النيتروجين السائل

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

في الموقع تلطيخ إمونوفلورزنت من البلعمة الذاتية في الخلايا الجذعية العضلات

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. Therapeutic options addressing the causes of muscular dystrophy pathogenesis are expected to alleviate muscle degeneration. Therefore, a method to assay and quantify the extent of cell death in muscle biopsies is needed. Conventional methods to observe myofiber degeneration in situ are either poorly quantitative or rely on the injection of vital dyes. In this article, an immunofluorescence protocol is described that stains necrotic myofibers by targeting immunoglobulin G (IgG) uptake by myofibers. The IgG uptake method is based on cell features characterizing the necrotic demise, including 1) the loss of plasma membrane integrity with the release of damage-associated molecular patterns and 2) the uptake of plasmatic proteins. In murine cross-sections, the co-immunolabelling of myofibers, extracellular matrix proteins, and mouse IgG allows clean and straightforward identification of myofibers with necrotic fate. This simple method is suitable for quantitative analysis and applicable to all species, including human samples, and does not require the injection of vital dye. The staining of necrotic myofibers by IgG uptake can also be paired with other co-immunolabelling.

Described here is a protocol for direct immunolabelling of necrotic myofibers in muscle cryosections. Necrotic cells are permeable to serum proteins, including immunoglobulin G (IgG). Revealing the uptake of IgG by myofibers allows the identification and quantification of myofibers that undergo necrosis regardless of muscle condition.