We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).

1. Tissue Colheita e congelamento dos tecidos musculares <ol><li> Eutanásia o rato com uma overdose de isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano). Execute esta etapa em um exaustor e usar um método de contenção secundária, como um secador ou uma redoma de vidro contendo um cotonete embebido em isoflurano. </li><li> Confirme a morte com firmeza apertando pata. Use um método secundário de eutanásia, como luxação cervical. </li><li> Molhar a pele com álcool a 70% para reduzir a aderência de fios de cabelo soltos sobre os músculos. Descasque a pele fora o membro usando uma pinça fina, tais como # 5. </li><li> Cuidadosamente separar o músculo de interesse (tibial anterior (TA), neste caso) a partir dos ossos por baixo, a partir do tendão e remover. </li><li> Extirpar o músculo, cobri-lo em outubro (de corte ideal composto de temperatura), e coloque-o deitado sobre um molde de congelamento descartável rotulados. Certifique-se de que o músculo está em sua orientação fisiológica normal (cabeça para tail) sem esticar. Alternativamente, congelar o músculo em pequenos quadrados de isopor e fixá-lo utilizando os pinos de insetos para garantir o comprimento correto dos músculos. </li><li> Relaxar 2-metilbutano (isopentano) em um copo de aço usando azoto líquido. Isso leva, em média, 3-5 min. Continue mexendo de forma intermitente até precipitados brancos começam a se formar no fundo e paredes do copo. NOTA: Quando isso ocorre, isopentano tenha alcançado a temperatura ideal de congelamento (-150 ° C) </li><li> Mergulhe os moldes contendo músculos na gelada de 2-metilbutano. Congelar pequenos músculos, como o diafragma e longus extensor digitorum (EDL) para 6-12 seg e músculos maiores, como o sóleo gastrocnêmio (GS) e tríceps para 15 - 20 seg. Não congelar os músculos por muito tempo, pois isso pode levar a fissuras. </li><li> Transfira os tecidos congelados sobre gelo seco e deixe evaporar isopentano (note que este processo leva em média cerca de 15 - 20 min). Enrole os tecidos em papel alumínio e armazená-los em ultra baixa temperatura (-70 ° C a -80 ° C) até o corte. </li></ol> 2. Incorporar os tecidos em outubro de Elaborar bloco de tecido <ol><li> Tecidos de transporte em gelo seco para cyrostat para evitar o descongelamento. Transferência para o tecido criostato câmara (definida a -20 a -24 ° C para evitar o descongelamento completo de tecidos) e deixá-los equilibrar durante 30 min. </li><li> Vire a baía Peltier de refrigeração por diante. Se o cryostat não tem esse resfriamento, use aerosol spray de arrefecimento para congelar rapidamente a outubro Não deixe que o degelo do músculo em qualquer ponto durante a incorporação, pois isso pode resultar em danos causados ​​por congelamento. </li><li> Adicione uma camada fina e uniforme de outubro no disco de amostra e deixe esfriar. Quando a maior parte dos PTU é congelada no fundo enquanto ainda líquido na parte superior, insira o tecido na orientação correta (perpendicular outubro para seções transversais e paralelas para outubro para cortes longitudinais). Use spray de aerosol arrefecimento para congelar rapidamente outubro Toque na parte unembeded do tecido com calor extractor e aguarde 45 segundos. </li><li> Adicionar outra camada fina de outubro em torno do músculo, pulverizador com de aerossol de pulverização de arrefecimento e extrair o calor tal como no passo anterior. </li><li> Continua a adicionar outubro em pequenos incrementos e congelar rapidamente OCT utilizando uma combinação de aerossol de pulverização e extractor de calor de arrefecimento até que todo o músculo é coberto. </li><li> Colocar o extractor de calor na parte superior do bloco de tecido e esperar durante 5 min. </li></ol> 3. Preparar Seções e identificando as secções de Mid-barriga Região dos Músculos <ol><li> Montar o espécime para o cabeçote da amostra. Aperte o botão para fixar o disco. Certifique-se de que o disco de amostra está em bom contato com o cabeçote de amostra. </li><li> Ajuste a temperatura da câmara de entre -21 e -24 ° C e aguarde até que a temperatura definida é alcançada. </li><li> Ajuste as configurações de espessura (7 um); aparar o bloco através do avanço ou retração do bloco usando configurações grossas e finas. </li><li> Recolher as seçõesem pré-aquecido lâminas de microscópio com carga positiva, pressionando a parte superior da lâmina para as secções, utilizando a atracção entre cargas opostas para facilitar a aderência das secções de corte na lâmina. </li><li> Identificar as secções médio-barriga por medição da área da secção transversa (AST) das secções. Faça isso usando software de imagem no computador que está ligado ao microscópio. NOTA: As imagens de contraste de fase são tomadas e circunferência de todo o músculo é medido através de uma função de rastreamento sobre o programa de software. Isto irá proporcionar tanto CSA, bem como diâmetro mínimo furão (medida de fibras de tamanho em corte transversal que é expressa como a menor distância entre duas tangentes paralelas em lados opostos de uma partícula) medições. Nota: Quando CSA e diâmetro mínimo ferret medições começar a platô, mid barriga foi atingido. </li><li> Inventário e arquivar as lâminas a -80 ° C para a coloração futuro. NOTA: o PTU não precisam ser removidos antes da staininprocedimentos de g. Uma vez que as lâminas são lamínulas, eles estão prontos para ser manchado imediatamente. </li></ol> 4. Coloração NOTA: Embora os procedimentos passo a passo detalhadas podem ser encontradas na folha de dados do produto e deve ser seguido por procedimentos de coloração, otimização de pessoal pode ser obrigado a obter a coloração ideal. <ol><li> Como meios de montagem (ver quadro) não seja miscível com água, por meio de lâminas de desidratar graus crescentes de álcool (2 min cada em 70%, 95%, e 100% de etanol) e limpá-las com xileno (100% durante 5 min) para garantir lâminas não se tornam opaca ao longo do tempo. </li><li> Lamela seções e deixe-os secar. Imagem com microscópio equipado com software de imagem. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies.">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li><li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica.">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li><li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscular+dystrophy.+I.+History,+clinical+status,+muscle+strength,+and+biopsy+findings.">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li><li>Platzer, A. C., Chase, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+Alterations+in+Preclinical+Mouse+Muscular+Dystrophy.">Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy.</a> The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).</li><li>Mercuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+magnetic+resonance+imaging+involvement+in+muscular+dystrophies+with+rigidity+of+the+spine.">Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine.</a> Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).</li><li>Tasca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+molecular+signatures+in+magnetic+resonance+imaging-staged+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy+muscles.">Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles.</a> PloS one. 7, e38779 (2012).</li><li>Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+apoptosis+improves+outcome+in+a+model+of+congenital+muscular+dystrophy.">Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy.</a> The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).</li><li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice,+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li><li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy.">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14 (2014).</li><li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis:+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A.">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li><li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy.">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+fixation.">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li><li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections.">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li><li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+'gold+standard'+for+immunohistochemistry.">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li><li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia.">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A histologia e imuno-histoquímica têm sido utilizados como ferramentas fundamentais para a compreensão da manifestação e progressão da patologia de várias desordens neuromusculares. Classicamente, biópsias musculares foram fixadas pela primeira vez em formaldeído e depois incorporado com cera de parafina. Enquanto fixação em formol preserva a arquitetura do tecido e permite o armazenamento e transporte de tecido à temperatura ambiente, também inativa enzimas e proteínas ligações cruzadas que obrigariam a...

O exame de histologia muscular desempenha um papel crítico na compreensão de diferentes tipos de distúrbios neuromusculares 1-4. Quando combinado com outras técnicas, permite que pesquisadores para ter uma idéia melhor da manifestação ea progressão da patologia e também pode ser essencial para avaliar a eficácia de uma intervenção terapêutica 5-10. No entanto, para ser exato, os tecidos precisam ser preservados de forma adequada, de modo a preservar o estado fisiológico imediatamente antes da excisão. Isso requer muito cuidado durante a remoção, preservação, seccionamento e coloração. Os tecidos podem ser preparados de duas maneiras diferentes para estudo microscópico luz. O método primeiro, fixados em formalina embebidos em parafina (FFPE) seções, requer tecidos fixados em formol 10% tamponado naturais antes de ser incorporado com cera de parafina 11,12. A etapa de fixação ajuda a preservar a morfologia melhor, mas também ligações cruzadas pr endógenooteins necessitando, portanto, de antigénios intrincado procedimentos de recuperação para a imunocoloração e eliminando a possibilidade de coloração enzimática em tais seções 12. As secções congeladas, por outro lado, não precisa de ser pré-fixo ou processado; por conseguinte, as proteínas são capazes de reter conformações nativas biológicos 13,14. Além disso, cortes congelados também permitem rápido tempo de resposta, que às vezes é necessário, por exemplo, no diagnóstico intra-operatório de sarcomas e outras biópsias cirúrgicas 15. No entanto, se não for feito corretamente, este método é propenso a congelar danos, que introduz alterações à arquitetura muscular fazendo as seções impróprios para exame histológico. Este artigo irá delinear o método mais eficaz para preparar biópsias musculares, a fim de alcançar uma óptima coloração para exame adequado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica CM 1850&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 
			Richard Allen Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse 50i&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. 
			Phone: +1-631-547-8500 
			Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Nikon Imaging Software Basic Research</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. 
			Phone: +1-631-547-8500 
			Image J, Metamorph</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>14043-220-05</td>
			<td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td>
			<td>JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>4583</td>
			<td>Sakura Inc.</td>
			<td>Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA 
			Leica Microsystem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze It</td>
			<td>23-022524</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable tissue mold</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colorfrost plus slides</td>
			<td>9991001</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>650501-4L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>HC-1300-1GL</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl butane</td>
			<td>M 32631-SL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HC-7001GA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 280</td>
			<td>8311-4</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Gill #3</td>
			<td>CS402-1D</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>6766007</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis

A avaliação histológica de biópsias do músculo tem servido como uma ferramenta indispensável para a compreensão do desenvolvimento e progressão da patologia de doenças neuromusculares. No entanto, a fim de fazê-lo, o cuidado apropriado deve ser tomado quando excisão e preservar tecidos para alcançar a coloração ideal. Um método de preservação de tecido envolve a fixação tecidos em formaldeído e, em seguida, incorporando-os com cera de parafina. Este método preserva morfologia bem e permite o armazenamento a longo prazo a temperatura ambiente, mas é difícil e requer a manipulação de produtos químicos tóxicos. Além disso, os resultados de fixação em formaldeído antígeno cross-linking, o que exige protocolos de recuperação antigênica para immunostaining eficaz. Pelo contrário, o seccionamento congelado não necessita de fixação e, assim, retém a conformação antigénio biológica. Este método também fornece uma vantagem distinta em volta rápida em torno do tempo, tornando-se especialmente útil em situações que necessitam de avaliação histológica rápido como intraoperativa biópsias cirúrgicas. Aqui nós descrevemos o método mais eficaz de preparação de biópsias musculares para visualização com diferentes colorações histológicas e imunológicas.

A instalação para a colheita e congelamento de tecidos pode ser visto na Figura 1. Tecidos excisados ​​deve ser armazenado em uma gaze embebida em PBS para evitar a secagem (Figura 1A). Quando os tecidos são selecionados para serem utilizados para análise histológica eles devem ser mergulhados em outubro e dispostas em molde crio na orientação adequada e tão perto de comprimento fisiológico possível para garantir a morfologia preciso (Figura 1B). Polpa de ...

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Do&#039;s and Don&#039;ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Fazer e não fazer na preparação de músculo Cortes congelados para análise histológica

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

do-s-don-ts-preparation-muscle-cryosections-for-histological

Research

JoVE Journal

Medicine

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

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