牽引力顕微鏡は細胞生成力を測定するために使用される。このプロトコルは、経験の浅いユーザーにアクセスしやすくするために、牽引力データの収集分析を簡素化します。既存の基準のない牽引力顕微鏡のプラットホームに対するこの技術の主な利点は、多光子リソグラフィーが個々の実験の必要性に従って迅速かつ容易なパターン設定の再設計を可能にする。
この新しい参照フリー牽引プラットフォームの作成と実装には、テキストだけではなく視覚的表現を通じて理解しやすい多くの重要なステップがあります。ベースヒドロゲルの光重合のために、まず、プレポリマー溶液の3マイクロリットルをパーフルオロアルコキシアルカンの薄い平らなシートに加え、平らな150マイクロメートル厚PDMSストリップを周囲に配置しますが、前ポリマー溶液のドロップには触れられません。PDMS上にアクリレートシラナイズカバースリップを置き、プリポリマー液滴をカバースリップの下に中央に置き、プリポリマー液滴をPDMSスペーサーの厚さに平らにします。
サンドイッチプレポリマー溶液を約1分間UV光に曝します。ヒドロゲルが完全に形成されたら、PDMSスペーサーからカバースリップを慎重に分離します。カバースリップにオープンボトムペトリ皿を取り付けるために高性能両面アクリル接着剤を使用してください。
ペトリ皿にヒドロゲルを積んだカバースリップを付着するときは、特別な注意を払ってください。濡れた皿やアプリケーション中の圧力が少なすぎると、漏れが発生し、サンプルが台無しになります。接着剤接触面に圧力をかけ、カバースリップ、接着剤、ペトリ皿の間に完全なシールを作成し、ガラスを割らないよう注意してください。
滅菌濾過されたPBSを使用してヒドロゲルをすすいだ。次に、ヒドロゲル合成のために調製したラボ溶液の800マイクロリットルに8マイクロリットルのNVPを加えます。バイナリイメージをデジタルマスクに変換するには、MATLABを開いて、runscript を開いて実行します。
m MATLAB スクリプト。変換するバイナリ TIF ファイルを選択し、リージョンのファイルを保存するフォルダを選択します。選択した画像の最終サイズをミクロンで入力します。
入力イメージは、これらのパラメータに合わせてスケーリングおよび寸法が設定されます。単一ピクセル配列を作成するには、[対象ジェネレータ オプションの領域] で、[小さい領域/単一ピクセル] の下にある [ティックを削除] チェックボックスをオフにし、[正方形] チェック ボックスをオンにして、[水平破断線] の [使用] をオフにします。次に、[OK] をクリックします。OVL ファイルは、以前に指定したフォルダーにあります。
顕微鏡ソフトウェアでファイルを開き、2つの光子レーザースキャンリソグラフィー中にレーザーシャッターを制御した所望の領域をロードします。次の手順は、最小限の光で実行する必要があります。低照度条件下での受託マーカーアレイの製造のために、前に調製したNVPラボ溶液の200マイクロリットルを20ミリグラムのAlexa Fluor 633と完全に混合し、ヒドロゲルを含む皿からPBSのすべてを取り除きます。
PEG-633混合物を、塩基ヒドロゲルを完全に包含する液滴としてヒドロゲルに加え、ペトリ皿を顕微鏡ステージのサンプルホルダーにロードします。その後、皿を覆い、パターニング溶液を少なくとも30分間ヒドロゲルに浸し、光から保護します。イメージング用の顕微鏡を構成するには、Alexa Fluor 488を視覚化するための適切なレーザーとフィルタを選択します。
PEG-488信号を使用してヒドロゲルを見つけ、検出器からの長い発光波長の収集をブロックします。垂直および水平タイル スキャンを使用して、XY 平面内のハイドロゲルの中心を特定し、この位置のステージをゼロにします。Zスタック関数でラインスキャンを使用してヒドロゲルの表面を見つけ、この位置でフォーカスをゼロにします。
XYセンターから離れたラインスキャンを繰り返してヒドロゲルをレベル付けし、必要に応じて、マイクロスコープステージ用のセットねじを調整して表面位置を特定します。顕微鏡ソフトウェアワークスペース内で、フォトパターン作成用の別の実験ファイルを作成し、マルチフォトンパワーを1.8%、スキャン速度を6に設定します。イメージフレームとピクセルのサイズを調整して、ピクセル単位で 0.1 マイクロメートルのピクセルサイズと 100 対 1 のアスペクト比を実現し、リージョン ファイルを領域のタブに読み込みます。
Z スタック関数を取得してオンにする領域をすべて設定するには、マクロを使用します。間隔を 3.5 マイクロメートルに設定し、合計深さ 28 マイクロメートル、Z スライスの総数を 9 に設定します。次に、Positions 関数を使用して、フィデューシャル マーカー配列がフォトパターン化されるヒドロゲル上の特定の位置を設定します。
ソークタイムが30分のマークに近づくと、5分ごとにヒドロゲルの表面の連続したZスタックラインスキャンを取得し、ゼロフォーカス位置に対する表面の位置の変化に基づいて腫れをチェックします。5分間に表面位置に変化が生じなかった場合は、パターニング設定を実行し、488ナノメートルレーザーを使用して、パターニング中にヒドロゲルの表面が動かなかったことを確認します。次に、顕微鏡からヒドロゲルを取り出し、ペトリ皿からPEG-633溶液を吸引し、滅菌濾過PBSで皿を洗い換えます。
細胞および受託マーカー画像を取得するには、ペトリ皿をサンプルホルダーに戻してパターン化された領域を見つけます。目的の細胞を見つけ、細胞の透過画像または蛍光画像を取得します。次に、示されているように、細胞の下にあるパターン化された配列のZスタックを取得し、細胞の送信または蛍光画像の第2のセットを取得する。
イメージ スタックを収集する場合、結果のイメージは、イメージ スタック内の Z 位置の関数として、強度で振動するパターン化されたフィーチャの通常の配列を表示する必要があります。追跡。mスクリプトは、前処理品質を評価するための蛍光受託者マーカーのZ投影、検出された重心のプロット、物体検出品質を評価するZ位置の関数として色分けされた、Z方向のカラムにリンクされた検出されたマーカー重心を表すトラックのプロットなど、いくつかの診断画像を提供し、オブジェクトトラッキング品質を評価します。
DISP 3D.mスクリプトは、特定の画像スタックで検出された特徴の各列のZ位置の関数として強度のプロットを提供し、受託者マーカー強度プロファイルの品質を評価します。両方の DISP 3D。
m と DISP のせん断。mは、各デカルト座標寸法における測定された変位ノイズのヒストグラムと、変位の補間されたヒートマップを提供します。また、インター final3D_2。
m は、外部委託されたコードを使用して計算されたサーフェス トラクションのヒート マップを提供します。この手順で覚えておくべき最も重要なことは、LAP を含むソリューションは光に敏感であり、周囲の光源から可能な限り保護する必要があります。NVPは揮発性有機化合物であり、常に化学流れフードで処理する必要があることを覚えておいてください。
