We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.

1. Iniciar o ciclo: Embriões de sementeira NOTA: O ciclo inicia-se com 1,5 g de material recolhido (uma mistura composta de embriões e / ou algumas larvas de primeiro estádio) a partir do ciclo anterior. Este material vai ser colocado num recipiente de plástico (ver tabela de materiais específicos / equipamento) com uma mistura de fermento activo até que a fase de pupa. O recipiente é fechado depois da introdução da mistura biológica de embriões e larvas com a tampa para evitar que as larvas de escapar. É necessário fazer furos na tampa, a fim de permitir a circulação de ar. Para evitar ter de escape larvas através dos orifícios, tampões de espuma são utilizados. Finalmente, recomenda-se usar luvas e bata de laboratório, não só nesta seção, mas também em todo o protocolo, para evitar que a roupa suja ou de coloração com lixívia. <ol><li> Configure o recipiente de plástico. <ol><li> Adicione três furos quadrados com uma lâmina de barbear na tampa do recipiente de plástico de umproximadamente 2,2 cm. Adicionar fita (fita de rotulagem de 3/4 de polegada) para os quatro cantos de cada orifício para assegurar um ajuste apertado para os tampões de espuma (50 x 55 mm, dxl), e, em seguida, colocar um tampão de espuma em cada buraco. </li><li> Cobrir o interior do recipiente de plástico com plástico. Sobre esta película, adicionar uma camada de algodão para cobrir o fundo do recipiente de plástico. Rasgar o algodão com os dedos. </li></ol></li><li> Preparar a comida mosca. <ol><li> Adicionar 333 ml de água desionizada num copo de 500 ml. Enquanto se agitava a proveta com uma barra magnética, adicionar 167 mL de ácido propiónico e 1,08 ml de ácido fosfórico, a partir das soluções de reserva (99,96% e 85%, respectivamente). </li><li> Lentamente, adicionar 77,5 g da levedura seca, evitando grandes aglomerações. Depois de dissolver a levedura seca, adicionar 38,8 g de sacarose. NOTA: Sacarose deve ser o último ingrediente a ser adicionado, porque imediatamente após a adição desse componente, a fermentação começa. </li></ol></li><li> Imediatamente após a dissolução da sacarose, o derramealimentos sobre o algodão, e certifique-se para cobrir o algodão uniformemente. Fechar o recipiente de plástico com a tampa para evitar moscas escaparam dentro do laboratório contaminando a comida. </li><li> Ressuspender 1,5 g de os embriões colhidos (não dechorionated) a partir do ciclo anterior com 5 ml de etanol a 70%. Cortado ao meio dois papéis de filtro e distribuir a mistura biológica uniformemente ao longo dos 4 pedaços usando uma espátula ou uma pipeta de transferência com uma grande ponta (corte se necessário). Coloque os papéis de filtro na parte superior do algodão embebido e feche a tampa. Finalmente, o recipiente de plástico incubar à TA (24ºC) e humidade (35%) até que a fase de pupa. NOTA: O recipiente de plástico não devem ser colocadas numa câmara húmida, de modo que esta vai estimular o crescimento de bactérias. </li></ol> 2. Continuação do Ciclo: a partir de embriões de moscas. NOTA: Esta parte do ciclo continua a partir dos embriões colocados no recipiente de plástico, no dia 1 até 9 dias mais tarde, quando as moscas adultas surgirãodo pupas. Durante estes 8 dias nada a ser feito, mas o acompanhamento que os embriões progredir corretamente para as próximas fases do ciclo de vida Drosophila até a eclosão. Se as larvas começam a morrer e se tornando negro durante este tempo, verifique se os plugs de espuma não estão muito apertadas e que haja uma ventilação adequada. Este período é um bom momento para limpar a gaiola população de moscas do ciclo anterior. <ol><li> Observar os embriões tornam-se 1 larvas st cerca de 24 horas após a fêmea adulta depositou-os na comida mosca (veja o passo 3). As larvas resultante irá alimentar a partir dos alimentos mosca preparada no passo 1 durante 4 dias, crescendo e muda duas vezes em 2 e 3 de larvas rd instar. </li><li> Limpar a gaiola população de moscas. <ol><li> Coloque a gaiola a 4 ° C durante pelo menos 30 min para abrandar a actividade das moscas. Remover o líquido que está cobrindo um lado da jaula, e com um movimento rápido, a tampa do lado aberto com um grande risco biológico de plásticoBolsa. Verter o conteúdo da gaiola dentro do saco. </li><li> Com o saco de risco biológico ainda cobrindo um lado da jaula, posicionar a gaiola verticalmente sobre uma pia com saco lateral do risco biológico para baixo. Retire cuidadosamente o saco plástico para evitar moscas escapando e descartá-lo em um recipiente de resíduos de risco biológico. </li><li> abra cuidadosamente o líquido superior o suficiente para criar um pequeno buraco, lavar o interior da gaiola com água, que vai lavar as moscas na pia. Lentamente, aumentar o tamanho do buraco e eliminar todas as moscas dentro da gaiola. </li><li> Limpar a gaiola e as duas redes com água e sabão. Enquanto as redes ainda estão molhadas fixá-los em ambos os lados da gaiola limpo e seco e, finalmente, colocar dentro de um papel de laboratório de imersão, o que impedirá o filme plástico preparado no passo 1.1.2 de degola para a gaiola. Agora, a gaiola está pronto para o próximo ciclo. </li></ol></li><li> Quatro dias após a configuração inicial, observar o pupate larvas. As larvas permanecem nesta fase por mais 4 dias. NOTADOurante esta fase da pupa vai cobrir a superfície de algodão inteiro dentro do recipiente de plástico. </li><li> Durante a fase de pupa e antes do primeiro moscas emergem, abrir o recipiente de plástico e colocar a película de plástico que contém o algodão com todas as pupas sobre o papel de imersão de laboratório dentro da gaiola população limpo. Feche o líquido com um nó duplo e limpar o recipiente de plástico e a tampa para o próximo ciclo. NOTA: As pupas afixada na tampa deve ser descartada e destruída por autoclavagem ou congelamento antes da eclosão. </li></ol> 3. moscas adultas. NOTA: Após os 4 dias da pupa andares, o primeiro moscas vai sair da pupa. Dentro de 24-48 hr todas as moscas deveria ter eclosed. Nesta parte do ciclo, é importante proporcionar-lhes alimentos com o objectivo de criar o ambiente certo para a reprodução. <ol><li> Preparar as bandejas de melaço. <ol><li> Combinar num balão de 1 L 556,25 ml de H2O desionizada, 90 ml de melaço, e 22 g de ágar. Autoclave com uma barra de agitação durante 30 min, arrefecer e adicionar 9,25 mL de 10% Tegosept em 95% de EtOH. </li><li> Despeje a mistura em uma bandeja de carne de 21 x 14,5 cm. Verifique se o volume é suficiente para cobrir 15 - 17 bandejas. Esperar 10 - 20 minutos para solidificar e cobrir cada bandeja com uma película de plástico para evitar a secagem. Vários frascos de 1 L podem ser preparados ao mesmo tempo. Armazenar as bandejas de melaço a 4 ºC embrulhado em plástico até ser necessário. </li></ol></li><li> Adicionar uma bandeja melaço coberto com levedura molhada dentro da gaiola com as moscas adultas. <ol><li> Antes de adicionar o prato, coloque a gaiola a 4 ºC na câmara fria durante 30 minutos. </li><li> Adicionar 200 ml de H2O desionizada para um copo e lentamente verter levedura seca, com agitação com uma colher. Interromper a adição de levedura seca, quando a mistura torna-se aproximadamente a consistência de manteiga de amendoim para evitar moscas ficar preso na comida. NOTA: É importante não permitir que a solução alimentar para solidificar caso contrário, será muito difícil para cobriro melaço bandeja e extrair os ovos durante o processo de colheita (ver secção 4.3). </li><li> Remover a película de plástico a partir de um tabuleiro de melaço e cobri-lo com uma camada de levedura fresca húmida preparada usando uma colher ou espátula. Certifique-se de que toda a superfície é coberta. </li><li> Enquanto a gaiola está ainda na câmara fria, abrir o líquido e adicionar cuidadosamente o tabuleiro de melaço com fermento húmido para dentro da gaiola. Fechar a rede e colocar a gaiola à TA. NOTA: Pode ser útil para cobrir a placa com uma bandeja de carne vazia durante a inserção, mas não se esqueça de bloquear o acesso das moscas para a bandeja de melaço. </li></ol></li><li> Mudar a placa de alimentos a cada 24-48 horas para evitar o fermento para ficar muito seco. moscas adultas são muito sensíveis à dessecação. </li></ol> 4. Fim do Ciclo: Colhendo os embriões NOTA: A melhor fertilidade mosca é de 3 - 5 dias após a eclosão. Portanto, a colheita durante este tempo vai obter o melhor rendimento do embrião. coleções Após desejados são completed, o ciclo é longo. As moscas deve ser sacrificado e a gaiola feita conforme especificado no passo 2.2. <ol><li> Normalmente, 2 dias após a eclosão da mosca, introduzir uma nova melaço bandeja com comida molhada fresca na gaiola, conforme explicado na secção 3.2.5. Para aumentar o rendimento da deposição de ovos, com a ajuda dos dedos, tornar a superfície do fermento molhado como irregulares quanto possível. Se uma bandeja de comida velha está presente na gaiola, antes de adicionar a nova placa, remova-o com cuidado e descartá-lo em um saco de risco biológico. Outra dica para aumentar o rendimento é remover a camada de algodão para que todos os ovos serão colocados no alimento. Manter a gaiola à TA. </li><li> Observe os embriões como pequenos pontos brancos. NOTA: Os ovos estão prontos para serem recolhidos. Para manutenção de rotina da gaiola mosca, coleta de 2 dias é o tempo recomendado. Esta coleção irá conter principalmente embriões e alguns 1 larvas st. Veja resultados representativos para os rendimentos típicos de embriões colhidos para vários collepontos de tempo cção. </li><li> Colher as embriões <ol><li> Coloque a gaiola na câmara fria por cerca de 30 min. No tempo médio preparar o recipiente de plástico e a comida mosca para o próximo ciclo, como explicado na secção 1. </li><li> Em uma autoclave de bandeja 8 L adicionar água a ¼ da capacidade total e, em seguida, adicionar 1 ml de 10% Triton X-100. Enquanto a gaiola está na sala fria remova cuidadosamente a placa de melaço e colocá-lo dentro de um saco de risco biológico. </li><li> Remova a bandeja do saco e submergi-lo rapidamente (para evitar moscas de escapar) na solução de detergente na gaveta do autoclave. Feche o saco de risco biológico e colocar em um recipiente de risco biológico. Moscas não vai se afogar em água que não contenha detergente. </li><li> Use um pincel grande e pistola de água destilada para lavar os embriões e levedura fora de melaço. Descartar placas e melaço na caixa de risco biológico. </li><li> Despeje solução cuidadosamente através de um conjunto de três peneira (mais grosseira crivo 30 no topo, 40 no meio e 100 na parte inferior). aglomerados de lavagem Sn nível superior com injetor de água destilada até que não haja aglomerados permanecem. NOTA: O moscas adultas e larvas 3 rd será retida na peneira 30. <ol><li> Lavar a bandeja de autoclave com água destilada e despeje a água de lavagem através das peneiras. Remover superior processo de peneira e repita se contiver pedaços de leveduras permanecem. A maior parte do 1 r e todas as larvas instar 2 ND permanecerá na peneira 40. </li></ol></li><li> Retirar o segundo crivo. O material amarelado na (parte inferior) terceira peneira é a mistura de embriões e pequeno 1 larvas st. Use pistola de água destilada para mover todos os ovos para um dos lados da peneira. Recolha-os com uma espátula e pesar. </li><li> Durante estes ciclos de o rendimento de recolha de embriões / larvas varia entre 7 e 13 g. Use apenas 1,5 g deste material para iniciar um novo ciclo (seção 1). Usar o resto dos embriões para processamento adicional ou podem ser descartados. </li></ol></li></ol> 5. DemaisEm processamento NOTA: Os embriões não utilizados para a continuação da população pode ser usado imediatamente para experiências ou, alternativamente, pode ser congelado a -80 ºC. Para ambas as opções, os embriões podem precisar de ser primeiro dechorionated. <ol><li> Para dechorionation, lave os embriões por 2 min em solução de água sanitária 50% e enxaguar abundantemente com água destilada. </li><li> Para congelar os embriões, primeiro secar pressionando firmemente com uma toalha de papel, e em seguida pesar e colocá-los, com a ajuda de uma espátula, em um 15 ou tubo de 50 ml. Finalmente submergir o tubo cónico em N2 líquido durante alguns segundos. </li></ol>

<ol>
	<li>Lim, S. J., Boyle, P. J., Chinen, M., Dale, R. K., Lei, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+localization+of+exosome+components+to+active+promoters+and+chromatin+insulators+in+Drosophila.">Genome-wide localization of exosome components to active promoters and chromatin insulators in Drosophila.</a> Nucleic Acids Res. 41, 2963-2980 (2013).</li><li>Ong, C. T., Van Bortle, K., Ramos, E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribosyl)ation+regulates+insulator+function+and+intrachromosomal+interactions+in+Drosophila.">Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila.</a> Cell. 26, 148-159 (2013).</li><li>Gonzalez, I., Mateos-Langerak, J., Thomas, A., Cheutin, T., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+regulators+of+the+three-dimensional+polycomb+organization+by+a+microscopy-based+genome-wide+RNAi+screen.">Identification of regulators of the three-dimensional polycomb organization by a microscopy-based genome-wide RNAi screen.</a> Mol Cell. 8, 485-499 (2014).</li><li>Magbanua, J. P., Runneburger, E., Russell, S., White, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variably+occupied+CTCF+binding+site+in+the+ultrabithorax+gene+in+the+Drosophila+bithorax+complex.">A variably occupied CTCF binding site in the ultrabithorax gene in the Drosophila bithorax complex.</a> Mol Cell Biol. 35, 318-330 (2014).</li><li>Maksimenko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+insulator+proteins,+Pita+and+ZIPIC,+target+CP190+to+chromatin.">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Res. 25, 89-99 (2015).</li><li>Lei, E. P., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+machinery+influences+the+nuclear+organization+of+a+chromatin+insulator.">RNA interference machinery influences the nuclear organization of a chromatin insulator.</a> Nat Genet. 38, 936-941 (2006).</li><li>Matzat, L. H., Dale, R. K., Moshkovich, N., Lei, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+regulation+of+chromatin+insulator+function.">Tissue-specific regulation of chromatin insulator function.</a> PLoS Genet. 8, e1003069 (2012).</li><li>King, M. R., Matzat, L. H., Dale, R. K., Lim, S. J., Lei, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+Rumpelstiltskin+antagonizes+gypsy+chromatin+insulator+function+in+a+tissue-specific+manner.">The RNA-binding protein Rumpelstiltskin antagonizes gypsy chromatin insulator function in a tissue-specific manner.</a> J Cell Sci. 1, 2956-2966 (2014).</li><li>Sisson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+large+populations+of+drosophila+for+protein+biochemistry.">Culturing large populations of drosophila for protein biochemistry.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2007).</li><li>Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+large+quantities+of+Drosophila+for+biochemical+experiments.">Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments.</a> Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).</li><li>Roberts, D. B., Standen, G. N., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elements+of+Drosophila+biology+and+genetics.">The elements of Drosophila biology and genetics.</a> Drosophila: A practical approach. , 1-53 (1998).</li><li>Ashburner, M., Roote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila:+The+laboratory+setup.">Culture of Drosophila: The laboratory setup.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2007).</li><li>Dahlberg, O., Shilkova, O., Tang, M., Holmqvist, P. H., Fb Mannervik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-TEb,+The+super+elongation+complex+and+mediator+regulate+a+subset+of+non-paused+genes+during+early+Drosophila+embryo+development.">P-TEb, The super elongation complex and mediator regulate a subset of non-paused genes during early Drosophila embryo development.</a> PLOS Genet. 13, e1004971 (2015).</li><li>Zhang, S. D., Odenwald, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misexpression+of+the+white+(w)+gene+triggers+male-male+courtship+in+Drosophila.">Misexpression of the white (w) gene triggers male-male courtship in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 6, 5525-5529 (1995).</li><li>Chak, L. L., Mohammed, J., Lai, E. C., Tucker-Kellogg, G., Okamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deeply+conserved,+noncanonical+miRNA+hosted+by+ribosomal+DNA.">A deeply conserved, noncanonical miRNA hosted by ribosomal DNA.</a> RNA. 21, 375-384 (2015).</li><li>Moshkovich, N., Lei, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1+recruitment+in+the+absence+of+argonaute+proteins+in+Drosophila.">HP1 recruitment in the absence of argonaute proteins in Drosophila.</a> PLOS Genet. 12, e1000880 (2010).</li><li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery.">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 63, 411-436 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Começando com 1,5 g de um material pode obter um rendimento de embriões recolhidos entre 7 e 13 g por ciclo. Para obter uma tal quantidade de material que é crucial para manter as condições de cultura adequadas para todas as fases do ciclo de mosca. Os parâmetros mais importantes são a temperatura e umidade, que deve ser de 24 ºC e 35%, respectivamente. Se estes dois parâmetros não pode ser mantido constante no ambiente normal do laboratório, uma possibilidade seria a de colocar a gaiola mosca em uma incubadora ou numa câmara ambiental. Outros protocolos recomendado 70% de humidade e também um ciclo de luz-escuro de 24 h constante para aumentar o rendimento dos ovos produzidos 9,10. No entanto mantendo a humidade cerca de 35% evita contaminação bacteriana, e uma vez que o objectivo deste protocolo é apenas a manutenção de uma população gaiola, as moscas são mantidas em ambiente de luz normal do laboratório. Outro ponto importante é manter disturbances para o adulto voa tão baixo quanto possível. Pode ser aconselhável manter a gaiola em um local separado da sala de voar para evitar a contaminação cruzada de outras moscas. A cultura de grandes populações de moscas mutantes transgénicos e não é recomendada, uma vez que é muito difícil manter a sua pureza e podem exibir um comportamento de acasalamento anormal pronunciada em grandes gaiolas populacionais 14. Um problema possível, enquanto a cultura de Drosophila em grandes quantidades, é a presença de outros organismos como os ácaros e / ou do molde, que irá competir para a comida e, por conseguinte, reduzir o rendimento de ovos produzidos. Para evitar isso, é muito importante para manter todo o equipamento limpa, lavagem da gaiola, redes e voar caixas com água e sabão, e desprezando o material descartável (tampões de espuma) depois de cada ciclo. Para reduzir o molde crescer, propiónico e ácido fosfórico são adicionados na levedura quando molhado preparando a comida mosca na etapa1.2 e Tegosept ao preparar o melaço bandeja no passo 3.1. Às vezes é útil para materiais lugar, como a caixa de plástico ou peneiras em -20 C, quando o tempo é curto e os materiais não podem ser limpos imediatamente. Um ciclo coleção inteira ocorre em 14 - 15 dias, começando quando os embriões são semeadas na caixa de mosca e termina com o último dia da coleta. Durante este período de tempo, recomenda-se para organizar uma agenda para lembrar todos os passos necessários para a manutenção de uma gaiola mosca população (Fig. 2), detalhados na seção de protocolo. A partir do dia em que os ovos são semeadas, até que as moscas adultas emergem, é necessário apenas para inspeccionar a caixa de plástico, e quando ocorre a formação da pupa, a colocá-los dentro da gaiola. Depois disso, as moscas têm de ser alimentadas a cada 2 - 3 dias até que os embriões são semeadas para um novo ciclo. Em todo o protocolo, o dia mais longo é durante a colheita e semeadura dos embriões para iniciar um novo ciclo. UMAs comentou no protocolo, a melhor produção de ovos é de 3 - 5 dias após a eclosão de adultos e, finalmente declina 2 dias mais tarde. Isso nos dá uma certa flexibilidade, a fim de escolher o dia em que a colheita dos ovos será realizada. Se por qualquer motivo o rendimento dos embriões colhidos é menor do que o montante de partida desejado (1,5 g), pode-se sempre adicionar uma nova bandeja de melaço e recolher mais ovos no dia seguinte. Para colecções constantes, recomenda-se manter a 2 gaiolas em paralelo, e se são necessárias quantidades mais elevadas de embriões, é também é possível utilizar maiores gaiolas. No caso de se fazer colecções de tempo curtos, uma maneira de aumentar o rendimento é o de tirar vantagem do sinal de sincronismo de postura de ovos pela manhã. Há muitas vantagens de recolher grandes quantidades de vários estádios de desenvolvimento. Por exemplo, embriões colhidos em gaiolas população têm sido usadas com muito sucesso em ensaios de imunoprecipitação 6-8, collectio massan dos tecidos larvais de larvas dissociada tem demonstrado ser uma boa fonte para 3C experiências 4 e preparações de ARN 15, e as cabeças de moscas adultas têm sido utilizados para experimentos chip 16. Além disso, os adultos são muitas vezes necessários para fazer extractos de voar por cultura de tecidos 17. Uma das aplicações mais promissoras da gaiola é fornecer material para ensaios de elevada produtividade que permitem a análise e rastreio de genes, transcrições, proteínas e metabolitos, em resposta à exposição de agentes patogénicos, as moléculas biológicas, substâncias químicas e radiação ionizante. Nestes ensaios em grande escala são necessários um grande número de indivíduos, e a população de moscas gaiola descrito aqui pode ser muito útil para a obtenção de grandes quantidades de material durante as diferentes fases do ciclo de vida de Drosophila para a sua análise e rastreio 18.

A capacidade de combinar abordagens genéticas e bioquímicas fez Drosophila um organismo particularmente adequada para Bioquímica e Biologia Molecular estudos 1-3. Estes estudos muitas vezes exigem grandes quantidades de material biológico, não só a partir de moscas adultas, mas também de larvas 4, pupas 5 e embriões 6-8. Para obter grandes quantidades de material, os pesquisadores têm moscas cultivadas usando recipientes grandes conhecidos como voar &quot;gaiolas população&quot;. Estas gaiolas consistem de um cilindro feito de plástico coberta por uma rede em ambos os lados para permitir a introdução do alimento no interior da gaiola, sem as moscas que escapam. Essas gaiolas podem ser caseiros 9-11 ou comprado de uma empresa (veja a tabela de materiais específicos / equipamento). Uma das principais vantagens da utilização deste sistema para crescer um grande número de moscas é que o ciclo de mosca da fruta 12 pode ser controlada de uma maneira que todas as moscas desenvolver em um relatively sincronizado maneira. Essa sincronização é conseguida semeando novos embriões, alimentando larvas / moscas e sacrificar as moscas adultas em momentos precisos. Usando uma população de moscas sincronizados é particularmente útil para estudos de desenvolvimento 13. O início de uma nova gaiola população de algumas moscas é um processo demorado que requer muitos ciclos de amplificação 9-11. Mesmo usando maiores recipientes como garrafas de cultura mosca ou minicages, todo o processo pode durar meses. Para evitar este passo demorado, muitos laboratórios de Drosophila manter regularmente essas gaiolas. É mais conveniente para iniciar uma nova gaiola a partir de uma colheita de embriões a partir de uma população gaiola já estabelecida. Em geral, a maioria dos laboratórios manter gaiolas população de tipo selvagem, tais como Oregon R ou S. Canton Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para manter gaiolas população de moscas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity practical cotton roll</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry yeast</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>23540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>1001-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam tube plugs</td>
			<td>Jaece</td>
			<td>L800-D2</td>
			<td>50 mm Diameter x 55 mm Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly population cage</td>
			<td>Flystuff</td>
			<td>59-116</td>
			<td>9&#8243; Diameter x 14.4&#8243; Length. Includes the nets for the cage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meat tray</td>
			<td>Genpak</td>
			<td>1002S (#2S)</td>
			<td>8.25 x 5.75 x 0.5 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molasses</td>
			<td>Grandma&#180;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container</td>
			<td>Rubbermaid</td>
			<td>4022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic film</td>
			<td>Glad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S 93326</td>
			<td>Toxic. Handle in Chemistry Hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A258-500</td>
			<td>Toxic. Handle in Chemistry Hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel&#160; sieve #100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>57324-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel&#160; sieve #40</td>
			<td>VWR</td>
			<td>57324-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel&#160; sieve #30</td>
			<td>VWR</td>
			<td>57324-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>MP</td>
			<td>152584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegasept</td>
			<td>LabScientific</td>
			<td>FLY5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintenance of a drosophila melanogaster population cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

A manutenção de uma população de moscas gaiola baseia-se no ciclo de vida da mosca. Portanto, após a colocação da mistura biológica inicial dos embriões e larvas no recipiente de plástico (Figura 1A) os ovos fertilizados se tornará larvas em não mais do que dois dias e as larvas irão crescer durante 4 dias, relativamente sincronizado através das diferentes fases de larvas instar ( ver Figura 1B). Depois de as larvas tenham completado o 3 rd instar fase larval eles vão pupate e cobrir a superfície do algodão no interior do recipiente de plástico com alguma na superfície interna da tampa (Figura 1C). Este período pupation vão para os próximos 4 dias até que as moscas concluir o processo de metamorfose. Durante este período, é altamente recomendável para transferir as moscas na gaiola. Os primeiros moscas adultas vai começar a EFeche no dia 9-10 após ainício do ciclo (Figura 1D) e dia 11 todos eles surgiram a partir da pupa. O melhor rendimento do conjunto de embriões é obtida 3 - 5 dias após a eclosão (dias 13 a 15) e, finalmente, diminui no dia 17 (7 dias após a eclosão). Portanto, recomenda-se adicionar a última bandeja de alimentos frescos no dia 13 e recolher os ovos no dia 15 (Figura 1E e F). Isto irá permitir a recolha de o número máximo de embriões. A adição de um terceiro dia extra, antes de recolher pode resultar no alimento ser demasiado seco e, consequentemente, diminuir o rendimento de embriões recolhidos. A Tabela 1 apresenta o rendimento de 6 colecções de ciclo consecutivos, com um material de partida de 1,5 g em cada ciclo, e a Figura 2 é a programação recomendada para uma coleção ciclo todo. O material colhido em dois dias60; períodos é na sua maioria composta de embriões. No entanto, um pequeno número de larvas são também presente. Para efeitos de manutenção gaiola estas larvas não são um problema, uma vez que é esperado algum grau de assincronia. No entanto, para algumas experiências bioquímica, a pureza destes embriões é muito importante, mas, ao mesmo tempo que também é necessário recolher grandes quantidades de ovos de realizar estas experiências. Por esta razão várias colecções consecutivos curtos foram realizadas a 1 h e 3 h, depois adicionar rapidamente à TA uma nova placa com os alimentos, para fornecer uma estimativa do rendimento e a pureza que pode ser obtida com este método (Tabela 2 e Figura 3) . Os 1 hr coleções consecutivas começou com um rendimento muito baixo (14,5 mg), mas, em seguida, as quantidades de embriões aumento para cada vez recolhido, mas a última vez. O baixo rendimento no início pode ser devido a que as moscas que está sendo forçada durante o processo de mudança da comida, mas mais tarde se aclimatando. Por outro lado, não LarVAE foram observados nos cinco colecções sequenciais (Figura 3A), que mostra que colecções mais curtos se obter uma pureza mais elevada. Se o algodão não é retirado da gaiola, a probabilidade de que as larvas de pontos de tempo anteriores permanecerá e introduzir a placa fresca é aumentada. Mesmo quando o algodão é removido, por vezes larvas irão caminhar sobre o lado da gaiola e entrar no alimento durante a recolha. Para os 3 hr coleções consecutivas, o rendimento variou 840-1250 mg, que é cerca de 10 vezes mais do que os rendimentos obtidos nas coleções hr 1. A pureza destes embriões foi próximo de 100% (Figura 3B). Foram observadas larvas ocasional. Alguns estudos de desenvolvimento requerem uma sincronização muito rigoroso para os embriões colhidos. Para aumentar a pureza de sincronização, é recomendado para descartar a primeira placa de recolha porque, se as condições não são ideais, as fêmeas podem reter mais ovos maduros e depositar om quando as condições de melhorar, por exemplo, com a introdução de uma placa fresca. Também é importante saber que as moscas adultas mais velhas (&gt; 6 dias) produzir embriões menos sincronizados. Para verificar o grau de sincronização com alta precisão, uma coloração DAPI dos embriões colhidos é recomendado. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53756/53756fig1.jpg" /> Figura 1. O Ciclo de Drosophila melanogaster Life in a Fly População Cage. (A) Início do ciclo de semeadura de 1,5 g de embriões para o recipiente caixa de plástico. Como uma referência, no painel inferior, o comprimento do papel de filtro é de 8,5 cm. (B) larvas em desenvolvimento relativamente sincronizado 5 dias após o início do ciclo. (C) No dia 8, a maior parte das moscas estão na fase de pupa. Os painéis inferiores em B (B) e C<html> (C &#39;) são ampliações das áreas indicadas nos painéis superiores. Moscas (D) Adulto emergiu da pupas 10 dias após o início do ciclo. (E) Adulto voa dentro da gaiola população antes de iniciar o processo de recolha dos embriões, no dia 15. O material amarelado na comida mosca são ovos fertilizados. (F) Embriões (e um larvas alguns) recolhido na parte inferior da peneira 100 grosseiro, depois de um ciclo de gaiola todo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53756/53756fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53756/53756fig2.jpg" /> Figura 2. Toda Coleção Ciclo de Programação. A Figura 2 mostra o esquema recomendado para um ciclo completo de recolha.<html> t = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53756/53756fig3.jpg" /> Figura 3. Pureza de 1 hora e 3 horas coleções consecutivos. Imagem representativa dos embriões colhidos em 1 hr (A) e 3 horas (B) após a adição de uma nova bandeja de comida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53756/53756fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table><tbody><tr><td> número do ciclo </td><td> Rendimento (g) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 9.5 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 12,7 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 7.1 </td></tr></tbody></table>ntent &quot;FO: manter-together.within-page =&quot;. 1 &quot;&gt; Quadro 1. Rendimento de várias colecções de ciclo Tabela 1 mostra o rendimento de 6 colecções de ciclo consecutivos, com um material de partida de 1,5 g Em cada ciclo, o último. bandeja de comida foi adicionado no dia 13 e a colheita foi feito no dia 15. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Coleção # </td><td> Comprimento de coleta (hr) </td><td> Rendimento (mg) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 14,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 21,6 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 56,1 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 1 </td><td> 160,1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 106,1 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 960 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 840 </td&gt; </tr><tr><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 1250 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Rendimento de 1 hora e 3 horas consecutivos Collections. A Tabela 2 mostra o rendimento de 5 coleções consecutivos 1 hora após a adição de novos alimentos e 3 coleções consecutivos de 3 horas depois de colocar uma nova placa de melaço.

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Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Manutenção de um<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Gaiola População

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

13.1K visualizações.  National Institutes of Health. This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Vídeo: Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biologia

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

De alta resolução de vídeo de Rastreamento Locomotion em Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Função de monitorização cardíaca em larval Drosophila melanogaster Para estudos fisiológicos

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissecção da Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medição do Tempo de vida em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imagem Através do Pupal Caso de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...