Name: transcutaneous assessment of renal function in conscious rodents
Uploaded: 2016-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
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ZHP was supported by the Marie-Curie project: NephroTools.

プロトコルを開発するために必要な実験は、国の規制に従って実施し、地域の倫理科学委員会（Regierungspräsidiumカールスルーエ）によって承認されました。 FITC-sinistrin注射液の調製<ol><li>ストック溶液を調製し、生理食塩水でFITC-sinistrinを溶解します。ラットでは5mg / 100gでBW FITC-sinistrinが好ましいが、マウスにおいて推奨される用量は、7.5ミリグラム/ 100g体重（BW）です。ラット40ミリグラム/ mlの濃度で調製しながらマウスで、15ミリグラム/ mlのFITC-sinistrinストック溶液の溶液を調製します。 注：FITC-sinistrinストック溶液を予め調製し、遮光し、-20℃で保存することができます。 </li></ol> 2.動物の準備<ol><li>いずれの実験ではそれらの導入前に少なくとも1週間のために動物を順応させます。 </li><li> 5 L /分のO 2、5％イソフルランを用いて動物を麻酔</sub&gt; 2分間流します。 </li><li>動物が適切に遅いと深くなるその呼吸を観察することによって麻酔されていることを確認し、つま先の応答の欠如と不応答性を確認します。 </li><li>動物が眠っているしたら、2リットル/分のO 2送達速度で2.5％イソフルランの麻酔を軽減し、BWを取ります。 </li><li>電気シェーバーを使用して、動物の背中の脇腹から毛皮を削除します。 3センチメートル×6センチ寸法を有する両面粘着パッチによって占有される領域よりもわずかに大きい面積を剃ります。 </li><li>続いて残りの毛皮を除去するために、短期間（2〜3分）のために脱毛クリームを適用します。 </li><li>クリームが完全に除去されるまでクリーム自体が蛍光することができるよう、徹底的に洗います。 注：それは刺激/浮腫を生成することができますように動物の皮膚に傷をつけないようにしてください。脱毛面積が皮膚に色素沈着を示している場合は、のための非着色スポットまで大きな面積を剃ります装置の光学部品が見出されます。麻酔の露出を最小限にするために、事前に24時間を剃ることをお勧めします。 </li></ol> 3.デバイスの準備<ol><li>保護箔と反対の部分を残して透明窓（ 図1）上記の光学部品を位置決め、両面接着パッチの片面に腎機能を測定するために光学素子を配置します。 注意：小さなげっ歯類を操作する場合は、図2に示すように、パッチのサイズを小さくしてください。 </li><li> 図3に示すように、バッテリにマッチサイズの両面接着パッチの一枚を取り付けます。 </li></ol>動物でのデバイスの4固定<ol><li>動物の体重に基づいて、注入の適切な量を計算します。 </li><li>以前のセクション2.1から2.3に示すように、イソフルランで動物を麻酔。 </li><li>筒状の弾性ガーゼ包帯oの部分をカットF両面接着パッチの幅よりも長い約1cmを使用します。 </li><li>明らかに剃った領域を残して、その背中に動物と場所の頭の上に弾性ガーゼ包帯を引き出します。 、代わりにのみ粘着テープを使用してデバイスを固定しますが、デバイス上の不当な圧力に注意してください 。 注意してください 。 </li><li>デバイス上の対応するポートにバッテリコネクタを差し込むことにより、デバイスにバッテリーを接続します。その後、パッチの片から保護フォイルを取り外し、デバイス（ 図4A）の上面にバッテリーを搭載。電池が正しくデバイスが点滅していることを確認することにより、接続されていることを確認してください。 注：ラットでは、電池はまた、次のデバイス（ 図4B）に、接着パッチ上に直接取り付けることができます。 </li><li>操作装置とパッチから保護カバーを取り外し、それを保持している動物の背中に毛を剃っ領域上に配置しますそれが正しく固定されるまで、sが縁。 </li><li>パッチの接着面に付着した筒状の弾性ガーゼの包帯（ 図5）を備えたデバイスをカバーしています。 </li><li>適切に手足が自由に移動できることを確認して、動物の腹部に筒状包帯を伸ばします。 </li><li>より優れた固定およびデバイスの保護のため、装置の形状次電池の配線を覆う粘着テープのストリップを適用します。 </li><li>デバイスに圧力をかけることなく、1〜3分間のバックグラウンドを測定します</li></ol> 5. FITC-sinistrin管理と測定手順<ol><li>必要に応じて、注射またはすべての手順に沿って温度制御された加熱プレートの前に暖かい水を使用して、動物の尾を温めます。 </li><li> FITC-sinistrin原液の適切な量尾静脈を介して注入します。注入量は、動物BWに依存し、したがって、それぞれの個々の短所のために計算されなければなりませんセクション1.1で上記の所望の投与量及びストック溶液の濃度を、idering。 </li><li>すべてのFITC-sinistrinソリューションは、静脈内ではなく、皮下に投与されていることを確認してください。 注：別の方法として、FITC-sinistrinは、事前に移植された静脈内カテーテルを用いて投与することができるげっ歯類またはマウスにおける眼窩注射を介して、首のうなじに終了しました。 </li><li>それは運動アーチファクトを導入するように慎重に、強い動きやデバイス上の任意の圧力を回避し、そのホームケージに動物を返します。 </li><li>動物が乱されることを避けるために、穏やかな場所にホームケージを置きます。 </li><li>マウス、2時間ラットを用いて作業している場合、少なくとも1時間の間に測定を行います。その期間中、光学装置は、皮膚を介してFITC-sinistrinが発する蛍光を測定します。 注：記録期間中に動物を単独でホストされる必要があります。さらに、水の供給、ならびに突出このようなワイヤ蓋などの構造は、物体との衝撃に起因する電子機器の損傷や運動アーチファクトを回避するために除去しなければなりません。 </li></ol> 6.デバイスの削除<ol><li>記録期間が終了すると、麻酔なしでデバイスを削除。必要な場合は、2分間、5 L / minのO 2供給速度で5％イソフルラン下で簡単に動物を麻酔。 </li><li>慎重に、その後管状の包帯、第1の粘着テープをやってのけます。 </li><li>優しく皮膚から両面粘着パッチを切り離し、その通常のホームケージに動物を返します。 </li></ol>データのうち7.読みます<ol><li>デバイスからバッテリーを取り外し、接着剤のパッチを削除。 注：新しい測定が開始されるまでのデータがデバイスに保存されています。バッテリが接続されているときに記憶されたデータは、新しい記録に上書きされます。そのため、データをダウンロードする前に、バッテリーを再接続しないでくださいデバイス。バッテリーの不慮の再接続のために意図された10秒の猶予期間があります。 </li><li>マイクロUSBケーブルを使ってPCにデバイスを接続し、付属のソフトウェアを使用してデータをダウンロードしてください。出力ファイルは、スプレッドシートプログラムで開くと変更することができる.csvファイルです。 </li><li>光学デバイスのための特定のソフトウェアとのデータファイルを開き、ソフトウェア・プロトコルを使用して除去動態曲線を生成します。 </li><li>光学デバイスに付属の説明書に従うことによって曲線を分析します。まもなく、データの評価のために、バックグラウンド信号は、前FITC-sinistrin管理を測定し、それぞれマウスおよびラットでは、通常、ボーラス注射後15分及び45分に発生マーカーの指数排泄相の開始をマーク設定。 注：このソフトウェアは自動的に1-比較例により決定し、R 2値と共にFITC-sinistrin半減期（t 1/2）が表示されますtmentモデル。 T 1/2は、変換係数9,10を用いてGFRを計算するために利用することができます。 </li></ol>

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NGは、FITC-sinistrinの生産に関する特許を保持しています。

本稿では、小型化、デバイスおよび外因性腎マーカーFITC-sinistrinを使用して、意識的なげっ歯類で腎機能を決定するための手順を説明します。前に述べたように、この方法は、尿および血漿クリアランスの従来の手順と比較していくつかの利点を有します。その一つは、動物のストレスを消耗、時間的に大きな節約につながると、当然の血液および尿サンプルからの独立です。 表2に示されるように、外因性腎マーカーFITC-sinistrinと皮膚を通してその除去速度の測定は、腎臓機能の腎病変の影響は9,10,14-18を研究することを可能にします。血漿クリアランスまたは腎疾患のバイオマーカーを評価するために必要な血液試料の直列コレクションは、動物のためのストレス面倒で時間のかかる研究のためのものです。そのため、同じ動物内のシーケンシャル測定がLIMされています動物や方法論的な理由の福祉によってited。経皮的測定13の証明内の動物の再現性は、それにより、疾患の進行や老化に腎機能の変化を検出するための理想的な方法になります。同じ理由で、また、治療法の有効性を研究するために非常に有用であり得ます。 この技術の成功のアプリケーションのための2つの重要なステップは、動物上の光学素子と、マーカーの正しい投与を固定しています。デバイスが適切に運動アーチファクトを回避するために修正する必要があります。それは、動物への接着性の損失、最終的に不適切な固定をもたらすことができるように、その目的のために、両面接着パッチの着脱を防止することが重要です。プロトコルで述べたように、粘着テープで覆うことにより固定化し、光学素子の保護adequatを確保するために有効なアプローチでありますE固定。 FITC-sinistrinボーラス注入を行う際には、静脈内ではなく、皮下、すべての物質を投与することが重要です。皮下組織中のマーカーの放出が容易にFITC-sinistrin自身の色によって生成された動物の尾を周回黄色のリングによって同定することができます。皮下注射は、一般的に平坦曲線と長期のマーカー排泄時間として現れます。この方法の可能な制限は、技術そのものよりも使用されるマーカーに複数の関連です。浮腫は、動物の皮膚に存在する場合、FITC-sinistrinの排泄動態を変化させることができ、追加の区画があるので、腎機能の経皮的評価は、推奨されないであろう。同様に、色素沈着した皮膚は、FITC-sinistrinとメラニンの重複励起および発光スペクトルに起因する技術の使用を制限することができます。しかし、パッチで皮膚の色素沈着を持つ動物で、問題は光を配置することによって解決されます。無着色領域内のデバイスの一部。 異なる動物種及び/又はアプローチする手順を適合させるために腎機能の経皮的評価のさまざまな側面を変更することが可能です。例えば、推奨FITC-sinistrin用量または測定の長さは、実験、ならびに異なる種または動物モデルの目標に応じて調節することができます。この方法の適応性は、既にげっ歯類、様々な健康状態を有する株のいくつかの種類の異なる種での成功したアプリケーションによって確認されています。また、腎機能の経皮的評価は、最近、優秀な成績で犬や猫12で検証されています。これらの動物とげっ歯類の間の紛れもない差のために、この研究では、イヌおよびネコの両方のためのFITC-sinistrinの適切な用量を決定し、それが時間を測定はるかに長いを行う、4時間の代わりに、1または2時間の使用げっ歯類中のd。 まとめると、私たちを助けることができるこの技術の使用は、腎疾患の進行の理解と治療の効果を含め、腎臓病でより正確な洞察を得るために。腎機能の経皮的評価の特徴は、将来的にはヒトおよび動物の臨床分野に適用されるのに適した技術としてそれを置き、伝統的なアプローチを置き換えるために有望な技術として考慮されるべきです。

糸球体濾過率（GFR）は、全体的な腎機能を評価するための最良のパラメータです。 GFRを決定するためのゴールドスタンダードは、イヌリン1などの外因性腎マーカーの尿中または血漿クリアランスに依存しています。しかしながら、これらの手順は、分析のためにシリアル血液及び/又は尿サンプルの収集および後部室アッセイを必要とする、時間がかかり、複雑です。また、これらの方法は、測定が繰り返されることが可能な時間と周波数の数を制限する、動物のための侵襲的ストレスです。 代替のアプローチの数は、GFRを決定するための古典的な手続きを簡略化するために開発されてきたが、それらはまだ尿および血漿サンプル2-4に依存し、および/ ​​または腎臓の血行動態機能7に影響を与えることが知られている深い麻酔5,6、必要8。例えば、クレアチニンなどの代謝の最終産物は、広く腎機能を推定するために使用されます。しかし、accurことが知られていますこれらの内因性マーカーのACYはまた、それらを分析するために、尿又は血液採取も不可欠であり、最適ではないと。 ここでは、意識のある動物に腎機能を評価するために経皮的方法論を説明します。この方法は、従来の方法と同様にのみ低侵襲性よりも簡単かつ高速です。小型化された光学素子と、外因性腎マーカーフルオレセインイソチオシアネート（FITC）-sinistrinを使用して、この技術では、血漿または尿サンプルおよび物質投与のための外科用カテーテルなし必要とせずに、ほぼリアルタイムでの腎機能を決定することが可能です。これらの特性には、この方法は、同じ動物において順次測定を行うのに適しています。 FITC-sinistrinは自由がない尿細管再吸収や分泌と、糸球体によってフィルタリング腎マーカーです。小型化された装置の光学部品は、励起する2つの発光ダイオード（LED）から成り投与マーカーフォトダイオードは、皮膚を介して放出される蛍光を検出します。記録されたデータは、デバイスに一体化内部メモリに格納され、それらは、FITC-sinistrin除去速度曲線を生成するために使用することができます。電力が小さいリチウム二次電池から供給されます。デバイスとその個々のコンポーネントの詳細についてはシュライバーら 9を参照してください。デバイスは、容易に光学部品のための透明な窓を搬送する両面接着パッチを使用して、動物の体に取り付けられています。記録期間が終わった後の結果は、容易に入手可能です。 ここで提供される方法およびプロトコルでは、我々は研究にも臨床の場だけでなく、GFRを決定するために、現在のゴールドスタンダードに取って代わる可能性が有望な技術をご紹介します。

<table><tbody><tr><td>NIC-Kidney device</td><td>Mannheim Pharma &amp;amp; Diagnostics GmbH</td><td></td><td>Software, batteries and chargers are provided together with the device/s. Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com</td></tr><tr><td>FITC-sinistrin</td><td>Mannheim Pharma &amp;amp; Diagnostics GmbH</td><td></td><td>Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com</td></tr><tr><td>Double-sided adhesive patch</td><td>Mannheim Pharma &amp;amp; Diagnostics GmbH</td><td></td><td>Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com</td></tr><tr><td>Isis Rodent electric shaver</td><td>Braun Aesculap&amp;nbsp;</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott GmbH&amp;nbsp;</td><td>PZN4831850</td><td></td></tr><tr><td>Leukosilk adhesive tape</td><td>BSN medical</td><td>102200</td><td></td></tr><tr><td>Tubular elastic gauze bandage&amp;nbsp;</td><td>MaiMed Medical GmbH</td><td>73012</td><td>There are different sizes available. Size 1 is recommended for mice.</td></tr><tr><td>Veet depilation cream</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>PZN7768307</td><td>Sensitive skin formulation is recommended as is more gentle with the skin of the animals</td></tr><tr><td>Micro USB cable</td><td>Samsung</td><td>APCBU10BBE</td><td></td></tr><tr><td>Deltajonin Physiologic solution</td><td>AlleMan Pharma GmbH</td><td>3366954</td><td>Alternatively, it can be used saline or PBS&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

transcutaneous assessment of renal function in conscious rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

経皮的測定のセットアップは非常にシンプルで早いのが特長です：デバイスはバッテリーが用意され、両面接着パッチ（ 図1）上に配置し、（ 図2）必要に応じてサイズが調整されている（ 図3）と接続されている（ 図4）。 腎機能を評価するためのこの方法は、すでに血漿クリアランス9,11,12の伝統的なアプローチとの比較により、異なる種で確認されています。ここで露出したプロトコルに続いて、シュライバーら 。すべてのグループが（ 表1）9 を勉強するための経皮的測定および血漿クリアランスの間で非常に匹敵する結果を示し、異なるマウスモデルにおける技術の有効性を実証しました。この作業で得られたT 1/2は 、マウスの特定の半経験的変換を使用してGFRに変換しました。因子。 腎機能の経皮的評価の一貫性はまた、マウスの異なる系統を用いて証明されています。同じ動物で3日以内にシーケンシャル測定値は3.0から6.2パーセント13の分散の係数を示しました。本研究でありGFRへの変換ではなかったが、結果は発現し、T 1/2の点で直接解釈しました。 ほぼリアルタイムで結果を有する可能性は、この方法の大きな利点の一つです。記録期間の後、結果は、分析のためにすぐに利用可能であり、提供されるソフトウェアは、瞬時にFITC-sinistrinの排泄曲線（ 図6）が表示されます。同じソフトウェア内FITC-sinistrinのT 1/2を直接GFRに換算の腎機能を評価するためのパラメータとして使用することができる、得ることができる。 図7 </st栄&gt;は、それが腎機能障害を有する動物に経皮的に測定されたFITC-sinistrin排泄曲線をどのように見えるかを示しています。腎機能が影響を受けている、FITC-sinistrin tの原因物質の減少排泄、曲線の変化の出現に1/2増加します。一般的に、測定曲線は、バック、バックグラウンドレベルまで来て、曲線下の増加面積を提示しません。同じ動物では、損傷後に前からの測定値は、その減少排泄によって引き起こされるマーカーの蓄積に最大蛍光強度の増加を体験することができます。腎不全の存在下では、FITC-sinistrinの経皮的測定曲線が原因で重度機能障害（ 図7B）に定常状態を表示することができます。 別の健康状態とのげっ歯類のいくつかの株で小型化されたデバイスの使用は、この技術をd、適切な変更を検出するのに十分な感度であることが示されていますUE腎疾患や老化に。 表2は、この方法でこれまでに研究されたマウスモデルの概要を示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig1.jpg" /> 両面接着パッチの装置の図1の配置は、装置は、接着パッチの位置に透明な窓での光学部品が取り付けられています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig2.jpg" /> 図2.小型のげっ歯類用接着パッチの適応は。小さな動物での使用のためには、パッチのサイズを小さくすることをお勧めします。 ：正しくパッチをカットするためのガイドとしてデバイスを使用してください。 B：所望のサイズが得られたら、装置は、パッチの粘着性表面上に配置することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig2large.jpg" target="_blank">P</a>リースこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig3.jpg" /> バッテリーの図3.準備が。デバイスにバッテリーを取り付けるには、両面接着パッチ（A及びB）の小片をカットし、バッテリ（C）の表面上に置きます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig3large.jpg" target="_blank">ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig4.jpg" /> 測定時の電池の図4.接続と配置。（A）マウスのような小型の齧歯類では、減少による空間に、バッテリーは、装置の上部に配置する必要があります。 （B）より大きな動物では、電池Cデバイスの横に置かれる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig5.jpg" /> ラットにおける管状弾性ガーゼ包帯の図5.配置。管状の包帯は、動物の快適さのために手足の自由な移動を妨害することなく、両面接着パッチをカバーする必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig5large.jpg" target="_blank">の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig6.jpg" /> FITC-sinistrinの脱離曲線の図6.代表的画像。FITC-sinistrinによって生成された信号は、トランスキューを検出しましたtaneouslyデバイスの内部メモリに格納されています。記録されたデータをPCにダウンロードされる場合、ソフトウェアは、画像中に提示されている1つに相当する曲線を生成します。 X軸は時間[分]で測定時間を表すY軸は、注入されたFITC-sinistrinマーカーによって放出された記録蛍光強度[AU]を、示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig7.jpg" /> 腎機能障害を有する動物におけるFITC-sinistrinの脱離曲線の図7.代表的画像。（A）腎機能低下を有する動物におけるFITC-sinistrin除去曲線は、典型的には、内のベースラインに到達するために曲線とできないことの下の増加面積を示しています通常の測定期間<html> 。 （B）重度障害のある動物に経皮的測定曲線は、腎不全を示し、定常状態を表示することができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/53767/53767table1.jpg" /> 伝統的な血漿クリアランスと比較することにより、経皮的測定の 表1 の検証。腎機能の経皮的測定は、異なるマウスモデルで検証された（健康と一方的に（UNX）C57BL / 6から129 SVマウスとnephronophthisisのマウスモデルを（摘出血漿クリアランスとの比較によるPCY））。値は平均±SDです。 GFR、糸球体濾過率9。 /53767/53767table2.jpg &quot;/&gt; 表2マウスモデルは、経皮的測定を用いて研究 UNX、一方の腎臓を摘出。 ACE、アンジオテンシン変換酵素; T gumodwt /重量 、トランスジェニックウロモジュリンノックアウト、SD、スプラーグドーリーラット; PKD、多発性嚢胞腎疾患。

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Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

コンシャスげっ歯類における腎機能の経皮評価

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

transcutaneous-assessment-of-renal-function-in-conscious-rodents

Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K ビュー.  Medical Faculty Mannheim, University of Heidelberg. Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

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Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kidney diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in the permeability barrier comprised of podocytes, vascular endothelial cells, and a basement membrane working in unison. Data from our laboratory using intravital 2-photon microscopy revealed a more permeable glomerular filtration barrier (GFB) than previously thought under physiologic conditions, with retrieval of filtered albumin occurring in an early subset of cells called proximal tubule cells (PTC)1,2,3.
Previous techniques used to study renal filtration and establishing the characteristic of the filtration barrier involved micropuncture of the lumen of these early tubular segments with sampling of the fluid content and analysis4. These studies determined albumin concentration in the luminal fluid to be virtually non-existent; corresponding closely to what is normally detected in the urine. However, characterization of dextran polymers with defined sizes by this technique revealed those of a size similar to serum albumin had higher levels in the tubular lumen and urine; suggesting increased permeability5.
Herein is a detailed outline of the technique used to directly visualize and quantify glomerular fluorescent albumin permeability in vivo. This method allows for detection of filtered albumin across the filtration barrier into Bowman's space (the initial chamber of urinary filtration); and also allows quantification of albumin reabsorption by proximal tubules and visualization of subsequent albumin transcytosis6. The absence of fluorescent albumin along later tubular segments en route to the bladder highlights the efficiency of the retrieval pathway in the earlier proximal tubule segments. Moreover, when this technique was applied to determine permeability of dextrans having a similar size to albumin virtually identical permeability values were reported2. These observations directly support the need to expand the focus of many proteinuric renal diseases to included alterations in proximal tubule cell reclamation.

A technique utilizing high resolution intavital 2-photon microscopy to directly visualize and quantify gloemrular filtration in surface glomeruli. This method allows for direct determination of permeability characteristics of macromolecules in both normal and diseased states.

ミュンヘンWistar系ラットにおける2光子顕微鏡を用いた蛍光高分子の糸球体透過性を定量化

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

医学

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is estimated to contribute to 19- 25% of all clinical cases of acute kidney injury (AKI) in critically ill patients. AKI detection has historically relied on metrics such as serum creatinine (sCr) or blood urea nitrogen (BUN) which are demonstrably inadequate in full assessment of nephrotoxicity in the early phase of renal dysfunction. Currently, there is no robust diagnostic method to accurately detect hemodynamic alteration in the early phase of AKI while such alterations might actually precede the rise in serum biomarker levels. Such early detection can help clinicians make an accurate diagnosis and help in in decision making for therapeutic strategy. Rats were treated with Cisplatin to induce AKI. Nephrotoxicity was assessed for six days using high-frequency sonography, sCr measurement and upon histopathology of kidney. Hemodynamic evaluation using 2D and Color-Doppler images were used to serially study nephrotoxicity in rats, using the sonography. Our data showed successful drug-induced kidney injury in adult rats by histological examination. Color-Doppler based sonographic assessment of AKI indicated that resistive-index (RI) and pulsatile-index (PI) were increased in the treatment group; and peak-systolic velocity (mm/s), end-diastolic velocity (mm/s) and velocity-time integral (VTI, mm) were decreased in renal arteries in the same group. Importantly, these hemodynamic changes evaluated by sonography preceded the rise of sCr levels. Sonography-based indices such as RI or PI can thus be useful predictive markers of declining renal function in rodents. From our sonography-based observations in the kidneys of rats that underwent AKI, we showed that these noninvasive hemodynamic measurements may consider as an accurate, sensitive and robust method in detecting early stage kidney dysfunction. This study also underscores the importance of ethical issues associated with animal use in research.

Early stage hemodynamic dysfunction is critical to the development of kidney disease. Yet, detection methodologies are limited. Recent advances in sonography provide a noninvasive, accurate option for early detection of kidney injury. This study outlines a step-by-step, sonographic methodology for detecting kidney dysfunction using a drug-induced nephrotoxicity rat model.

ラットにおける超音波検査技術を用いた薬剤誘発性腎血行動態機能障害の早期発見

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Novel Approach for Simultaneous Recording of Renal Sympathetic Nerve Activity and Blood Pressure with Intravenous Infusion in Conscious, Unrestrained Mice.

Renal sympathetic nerves contribute significantly to both physiological and pathophysiological phenomena. Evaluating renal sympathetic nerve activity (RSNA) is of great interest in many areas of research such as chronic kidney disease, hypertension, heart failure, diabetes and obesity. Unequivocal assessment of the role of the sympathetic nervous system is thus imperative for proper interpretation of experimental results and understanding of disease processes. RSNA has been traditionally measured in anesthetized rodents, including mice. However, mice usually exhibit very low systemic blood pressure and hemodynamic instability for several hours during anesthesia and surgery. Meaningful interpretation of RSNA is confounded by this non-physiological state, given the intimate relationship between sympathetic nervous tone and cardiovascular status. To address this limitation of traditional approaches, we developed a new method for measuring RSNA in conscious, freely-moving mice. Mice were chronically instrumented with radio-telemeters for continuous monitoring of blood pressure as well as a jugular venous infusion catheter and custom-designed bipolar electrode for direct recording of RSNA. Following a 48-72 hour recovery period, survival rate was 100% and all mice behaved normally. At this time-point, RSNA was successfully recorded in 80% of mice, with viable signals acquired up to 4 and 5 days post-surgery in 70% and 50% of mice, respectively. Physiological blood pressures were recorded in all mice (116&plusmn;2 mmHg; n=10). Recorded RSNA increased with eating and grooming, as well-established in the literature. Furthermore, RSNA was validated by ganglionic blockade and modulation of blood pressure with pharmacological agents. Herein, an effective and manageable method for clear recording of RSNA in conscious, freely-moving mice is described.

Anesthetized mice exhibit non-physiological systemic blood pressure, which precludes meaningful assessment of autonomic tone given the intimate relationship between blood pressure and the autonomic nervous system. Thus, a novel method to simultaneously record renal sympathetic nerve activity and blood pressure with intravenous infusion in conscious mice is outlined.

腎交感神経活動と意識、持続静脈内投与による血圧の同時記録への新しいアプローチ気ままなマウス。

Renal sympathetic nerves contribute significantly to both physiological and pathophysiological phenomena. Evaluating renal sympathetic nerve activity ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

意識マウスにおける糸球体濾過率の測定のためのハイスループット法

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

生物学

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

マウスにおける糸球体濾過率の経皮吸収測定

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

生理学ラボデモンストレーション：ラットにおける糸球体濾過率

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain slices and neuronal cell cultures. Recently, this technology has been applied to the whole organs. Advances in sensor design have made &#160;possible the measuring of&#160;cell signaling in blood-perfused in vivo kidneys. The present protocols list the steps needed to measure ATP and H2O2 signaling in the rat kidney interstitium. Two separate sensor designs are used for the ex vivo and in vivo protocols. Both types of sensor&#160;are coated with&#160;a thin enzymatic biolayer on top of a permselectivity layer to give fast responding, sensitive and selective biosensors. The permselectivity layer protects the signal from the interferents in biological tissue, and the enzymatic layer utilizes&#160;the sequential catalytic reaction of glycerol kinase and glycerol-3-phosphate oxidase in the presence of ATP to produce H2O2. The set of sensors used for the ex vivo studies further detected analyte by oxidation of H2O2 on a platinum/iridium (Pt-Ir) wire electrode. The sensors for the&#160;in vivo studies are instead based on the reduction of H2O2 on a mediator coated gold electrode designed for blood-perfused tissue. Final concentration changes&#160;are detected by real-time amperometry followed by calibration to known concentrations of analyte. Additionally, the specificity of the amperometric signal can be confirmed by the addition of enzymes such as catalase and apyrase that break down H2O2 and ATP correspondingly. These sensors also rely heavily on accurate calibrations before and after each experiment. The following two protocols establish the study of real-time detection of ATP and H2O2 in kidney tissues, and can be further modified to extend the described method for use in other biological preparations or whole organs.

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

酵素バイオセンサの使用は、内因性ATPまたはHを定量します<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt;腎臓で

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Long-Term Continuous Measurement of Renal Blood Flow in Conscious Rats

The kidneys play a crucial role in maintaining the homeostasis of body fluids. The regulation of renal blood flow (RBF) is essential to the vital functions of filtration and metabolism in kidney function. Many acute studies have been carried out in anesthetized animals to measure RBF under various conditions to determine mechanisms responsible for the regulation of kidney perfusion. However, for technical reasons, it has not been possible to measure RBF continuously (24 h/day) in unrestrained unanesthetized rats over prolonged periods. These methods allow the continuous determination of RBF over many weeks while also simultaneously recording blood pressure (BP) with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry). RBF monitoring is carried out with rats placed in a circular servo-controlled rat cage that enables the unrestrained movement of the rat throughout the study. At the same time, the tangling of cables from the flow probe and arterial catheters is prevented. Rats are first instrumented with an ultrasonic flow probe placement on the left renal artery and an arterial catheter implanted in the right femoral artery. These are routed subcutaneously to the nape of the neck, and connected to the flowmeter and pressure transducer, respectively, to measure RBF and BP. Following surgical implantation, rats are immediately placed in the cage to recover for at least one week and stabilize the ultrasonic probe recordings. Urine collection is also feasible in this system. The surgical and post-surgical procedures for continuous monitoring are demonstrated in this protocol.

The present protocol describes a long-term continuous measurement of renal blood flow in conscious rats and simultaneously recording blood pressure with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry).

意識のあるラットにおける腎血流の長期連続測定

The kidneys play a crucial role in maintaining the homeostasis of body fluids. The regulation of renal blood flow (RBF) is essential to the vital ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mechanically Ventilated Piglets

Transdermal measurement of glomerular filtration rate (GFR) has been used to evaluate kidney function in conscious animals. This technique is well established in rodents to study acute kidney injury and chronic kidney disease. However, GFR measurement using the transdermal system has not been validated in pigs, a species with a similar renal system to humans. Hence, we investigated the effect of sepsis on transdermal GFR in anesthetized and mechanically ventilated neonatal pigs. Polymicrobial sepsis was induced by cecal ligation and puncture (CLP). The transdermal GFR measurement system consisting of a miniaturized fluorescence sensor was attached to the pig's shaved skin to determine the clearance of fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin, an intravenously injected GFR tracer. Our results show that at 12 h post-CLP, serum creatinine increased with a decrease in GFR. This study demonstrates, for the first time, the utility of the transdermal GFR approach in determining renal function in mechanically ventilated, neonatal pigs.

Glomerular filtration rate (GFR) is the ideal marker for assessing kidney function. However, the standard measurement method using inulin injection with serial blood and urine analysis is impractical. This article delineates a practical method to measure GFR transdermally in piglets.

機械的換気仔豚における糸球体濾過率の経皮吸収型測定

Transdermal measurement of glomerular filtration rate (GFR) has been used to evaluate kidney function in conscious animals. This technique is well ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

注入カテーテル電極の繰り返し測定を可能にすると目がさめているラットの膀胱内圧測定と外部尿道括約筋の測定

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...