Name: analysis of brain mitochondria using serial block-face scanning electron microscopy
Uploaded: 2016-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
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We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) al Virginia Tech. Attenzione: le precauzioni estreme devono essere prese nel maneggiare e smaltire diversi componenti utilizzati in questo protocollo. Prima dell&#39;uso, la linee guida istituzionali e le pratiche di salute e sicurezza locale devono essere stabilite e seguite, in particolare per tetrossido di osmio, che è volatile ed estremamente velenoso, acetato di uranile, che è sia un metallo pesante e la fonte di radioattività, e nitrato di piombo, che è un veleno di metalli pesanti. Thiocarbohydrazide (TCH) può scomporre per la produzione di gas esplosivi e velenosi, se non correttamente gestito. Molte istituzioni avranno una funzione di base EM in cui questi reagenti sono regolarmente utilizzate e in grado di fornire assistenza. 1. Preparazione del tessuto cerebrale e SBFSEM Imaging <ol><li> Anestetizzare un giovane (~ 2 - 4 mesi di età) C57 topo nero (C57BL / 6J ceppo) con 4-5% isoflurane seguendo le linee guida istituzionali. Confermare anestesia monitorando la perdita di tono muscolare, la mancanza di movimenti volontari e le risposte agli stimoli avversi come un pizzico di coda. </li><li> Pin il mouse su un vassoio dissezione e fare un&#39;incisione sulla pelle lungo la linea mediana ventrale. Fare ulteriori incisioni nella pelle per esporre la gabbia toracica del mouse. Incidere la membrana, e con attenzione sezionare cavità toracica lungo la periferia per esporre il cuore pulsante e quindi fare un&#39;incisione sul atrio destro. </li><li> Utilizzando una cannula farfalla, cannulate il ventricolo sinistro. Profumato il mouse transcardially utilizzando 10 - 20 ml di tampone fosfato salino (PBS) pH 7,2, fino dissanguamento è confermato da un cambiamento di colore del fegato. Nota: Una modifica del colore del fegato è utilizzato come guida per determinare il grado di dissanguamento. Verificare che i cambiamenti di colore del fegato dal bruno rossastro al rosa pallido. </li><li> Profumato il mouse transcardially utilizzando 10 - 20 ml di 2% glutaraldeidi e il 4% paraformaldeide fatto in 0,10 M tampone cacodilato (pH 7,2), per risolvere rapidamente il tessuto cerebrale dall&#39;interno. Fixation viene monitorato osservando l&#39;irrigidimento coda. Nota: Preparare 0.10 M cacodilato tampone (pH 7,2) sciogliendo 2,14 g di cacodilato di sodio in 80 ml di acqua, aggiungere acido cloridrico per regolare il pH, e rendere il volume a 100 ml con acqua. </li><li> Dopo perfusione, decapitare il mouse, sezionare il cervello, seguito da fissaggio in 0,10 M tampone cacodilato di sodio (pH 7,2) contenente 2% di glutaraldeide e 4% paraformaldeide per 48 ore a 4 ° C. </li><li> Dopo 48 hr rendere 400 micron sezioni coronali utilizzando un vibratome e poi sezionare accuratamente la regione di interesse nel cervello (per esempio, l&#39;ippocampo) al microscopio di dissezione 42. Rifilare con cura il tessuto e scattare una foto per preservare l&#39;orientamento. Nota: post metodi di lavorazione di colorazione dei tessuti in SBFSEM combina una varietà di metodi di colorazione di metalli pesanti inPer migliorare la risoluzione e sono basati sul metodo sviluppato in precedenza dal Deerinck et al 40. </li><li> Lavare i tessuti glutaraldeide-fisso per 3 volte, 5 minuti ciascuno in 0.1 M tampone cacodilato (pH 7,2). </li><li> Preparare la soluzione di acido tannico 0,1% sciogliendo acido tannico in 0.1 M tampone cacodilato di sodio (pH 7,2). Agitare fino a scioglimento e filtrare 0,45 micron filtro se necessario. </li><li> Postfix i tessuti con cacodilato tamponata 0,1% di acido tannico incubando in 1 ml di reagente per 30-60 minuti a temperatura ambiente. Nota: Il tempo di incubazione dipende dalla dimensione dei tessuti, ma 30 minuti funziona meglio per la maggior parte dei tessuti. </li><li> Lavare i tessuti 3 volte, 5 minuti ciascuno a tampone cacodilato (pH 7,2). </li><li> Sciogliere 0,3 g ferrocianuro di potassio e 0,86 g di sodio cacodilato in 10 ml di acqua distillata H 2 O (DH 2 O). Conservare la soluzione ferrocianuro di potassio sul ghiaccio. Appena prima dell&#39;uso, aggiungere 10 ml di 4% tetrossido di osmio (OSO 4). </li><li> Macchiare i tessuti con il 2% ossoluzione MIUM-ferrocianuro per 90 min, sul ghiaccio. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno in DH 2 O. </li><li> Preparare la soluzione (TCH) 1% thiocarbohydrazide sciogliendo 0,1 g TCH in 10 ml dH 2 O. Sciogliere a 60 ° C agitando ogni 10 minuti fino a completo scioglimento. Osservare le precauzioni di sicurezza durante la manipolazione TCH, in particolare fare attenzione ad evitare l&#39;uso di metalli, riscaldamento ad alta temperatura, o una soluzione che permette di asciugare. </li><li> Trattare i campioni con preparati al 1% TCH per 20 minuti a RT. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno in DH 2 O. </li><li> Diluire 4% OsO 4-2% con dH 2 O, tessuti macchia con 2% acquosa tetrossido di osmio incubando per 1 ora. Lavare i tessuti per 3 volte, 5 minuti ciascuno con dH 2 O. </li><li> Incubare i campioni O / N in 1% acetato di uranile in DH 2 O a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione aspartato vantaggio di Walton (come descritto da Deerinck et al 40). <ol><li> Sciogliere 0,998 g L-aspartato in 250 ml di dH 2 Oe quindi aggiungere 10 N di idrossido di potassio (KOH) in modo goccia a goccia fino a pH 5,5. Dopo la regolazione del pH, aggiungere 0,066 g di nitrato di piombo in 10 ml di acido aspartico magazzino e si riscalda a 60 ° C per 30 min. </li></ol></li><li> Lavare i tessuti in DH 2 O e incubare con macchia aspartato vantaggio di Walton per 30 minuti in un forno a 60 ° C. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno in DH 2 O. </li><li> Disidratare campioni attraverso una serie graduata di alcol utilizzando soluzioni refrigerate di 20%, 50%, 75%, 85% e 95% di etanolo per 5 minuti ciascuno, seguito da 100% di etanolo per 3 volte, 10 minuti ciascuno. Nota: utilizzare 100% di etanolo dalla bottiglia appena aperta, come l&#39;etanolo aperto assorbe l&#39;acqua dall&#39;aria e causare l&#39;incorporamento di fallire. incubazioni più lunghe saranno necessari con campioni di tessuto di grandi dimensioni. </li><li> Lavare i campioni 2 volte, 15 min ciascuno in ossido di propilene. </li><li> Fai la resina plastica embedding utilizzando 25 ml di resina, 10,5 ml DDSA (Dodecenyl succinica), 15,5 ml NMA (Nadic metile anidride) e 1 mlDMP-30 (2,4,6-Tris dimetilamminometil fenolo). Mescolare la resina agitando. Spin e consentire alla resina di riposare fino a quando bolle determinazione. Nota: Questa è la ricetta durezza media standard. Altri tipi di microscopia elettronica (EM) resina plastica possono essere utilizzati, ma devono essere testati con un campione di controllo non essenziale in anticipo come non tutte le resine lavorano per SBFSEM. </li><li> Incubare i tessuti O / N a 50: 50 mix di incorporamento resina e propilene ossido, in una fiala che è ricoperto inizialmente, poi livellata dopo 2 ore in modo che l&#39;ossido di propilene evapora nel periodo di circa 8 - 10 ore. </li><li> Trasferire i tessuti al 100% di resina embedding fresco in fiale pulite per 2 ore. </li><li> campioni Incorpora in resina embedding fresca, in stampi piatti contenenti stampate etichette di carta, e li cura in forno a 60 ° C per 48 ore. Dopo circa 1 ora, controllare il posizionamento dei tessuti e l&#39;allineamento di nuovo, e regolare se necessario. </li><li> Tagliare i campioni per l&#39;area di interesse e montare su un perno in alluminio utilizzando Gelling cianoacrilato colla o una resina epossidica conduttiva, poi cappotto con argento colloidale pasta intorno ai lati del blocco per fornire un percorso conduttivo al perno di alluminio. </li><li> Esaminate campioni di tessuto utilizzando un sistema microscopio elettronico dotato di uno stadio ultramicrotomo in-camera e basso kV rivelatore retrodiffusi elettroni 32. Nota: Ottenere strumento- e il sito-formazione in microscopia elettronica a scansione (SEM) utilizzare e diventare un utente autorizzato. In alternativa, la collaborazione con una struttura di ricercatore o di base per piccoli progetti può essere possibile. formazione radiazioni può anche essere richiesto come SEM generano raggi x. </li><li> Per l&#39;immagine dei campioni, utilizzare le seguenti impostazioni: 2,25 kV, a 5 - 10 nm / pixel di risoluzione, con dimensioni del campo tra 80-250 micron in x, y (dimensioni possibile altro campo), e lo spessore fetta di 50 - 100 nm, con un totale di 250 - 600 fette in un 16 - periodo 20 hr. Nota: Le impostazioni variano notevolmente tra i diversi microscopi, indicampioni individuali, e risoluzione desiderata. Queste impostazioni dovrebbero produrre immagini che sono prontamente interpretabili per molti campioni. </li></ol> 2. Analizzando il set di dati di imaging Nota: l&#39;immagine del software J / Fiji viene utilizzato per analizzare l&#39;insieme di dati e si basa su il plugin TrakEM2. passi di preelaborazione possono essere eseguiti utilizzando una varietà di software, e può essere estesa o minore a seconda del livello di esperienza e le pile ottenuti. I principali trasformazioni che utilizzano il software open-source (ImageJ ver 1.50b, FIJI scaricare 1 ottobre 2015) sono descritte qui. <ol><li> Convertire le immagini in formato TIFF a 8 bit dalle immagini a 16 bit proprietarie originali aprendo nel software e selezionare le voci di menu Immagine → Tipo → 8 bit. <ol><li> Se la conversione automatica di contrasto / luminosità in questa fase non è l&#39;ideale per le immagini, può riaprire il immagini a 16 bit, e premere il tasto Immagine → Regola → Luminosità / Contrasto. Selezionare un intervallo che funziona per tutte le immagini, e premere Apply. Quindi eseguire cLA CONVERSIONE. Nota: Su alcuni SEM, questo passaggio potrebbe richiedere software produttore microscopio. </li><li> Se necessario, a causa di movimenti immagine inaccettabile tra fette (ad es. Alla deriva a causa di carica), registrazione / allineare le pile di immagini (voci di menu Plugin → Registrazione → lineare StackAlignmentWithSIFT). Nella maggior parte dei software di registrazione, impostare per la modalità &quot;traduzione-only&quot;, piuttosto che &quot;corpo rigido&quot;. Nota: Molti approcci e software possono lavorare: la registrazione SIFT plug-in di lavori per molte applicazioni e non vi è una versione stack virtuale. <ol><li> Se necessario, allargare le dimensioni della tela prima della registrazione (Immagine → Regola → dimensionesfondo) o ridurlo ad una zona di interesse (Immagine → Ritaglia). Nota: possono verificarsi un trascinamento o divaricazione, e cercando altri plugin o software può produrre risultati migliori. Opzioni manuali sono disponibili anche (ad es. ImageJ / FIJI, Plugin → Registrazione → ManualLandmarkSelection). </li></ol></li><li> Se desirEd, immagini in scala ai più piccoli, dimensione più gestibile (ad es. 25%) utilizzando ImageJ (Immagine → Scala). </li></ol></li><li> Avviare il software, selezionare File → Importa → sequenza di immagini e quindi selezionare i file TIFF. </li><li> Lanciare il plugin selezionando File → Nuovo → TrakEM2 (vuoto). Due finestre si apriranno; uno gestisce il progetto e area_lists e l&#39;altro gestisce tracciato, e si riferisce a come la &#39;tela&#39;. </li><li> Caricare la risma immagine nel plug-in facendo un clic destro sul importazione tela. Selezionare l&#39;importazione e fare clic sulla pila di importazione. Nelle opzioni pop-up, selezionare la casella per gli stack virtuali. Nota: Anche se le pile di immagini sono già aperti nel software, devono essere aperti anche nel plugin. Il computer può eseguire più agevolmente se la casella di stack virtuale sia selezionata. </li><li> Dopo le mipmap vengono creati e lo stack è stato caricato, fare clic destro per denominare il progetto sotto la finestra del plugin. Fare clic destro su &#39;nuovo progetto&#39; nel modello column, e selezionare &#39;aggiungi nuovo bambino&#39; per quel progetto. clicca di nuovo a destra per selezionare &#39;area_list&#39;. </li><li> Impostare la scala asse Z del progetto d&#39;accordo con le impostazioni originali microscopio elettronico facendo clic destro su tela, quindi fare clic su Visualizza e selezionare la calibrazione. Inoltre, impostare la Z-scala selezionando tutti i livelli nella finestra del plugin, fare clic destro per selezionare scala Z e spessore. </li><li> Fare clic e trascinare il &#39;progetto&#39; e tutti i &quot;bambini&quot; nel progetto oggetti sezione per creare le &quot;liste di zona &#39;nella scheda&#39; spazio Z &#39;nell&#39;area di disegno. </li><li> Selezionare la &#39;lista zona&#39; e fare clic destro per selezionare e impostare un colore. Ora, utilizzare lo strumento pennello per tracciare oggetti come i mitocondri, nelle immagini al microscopio elettronico. Usare &#39;Shift + click&#39; di compilare un cerchio chiuso, &#39;Ctrl + scorrimento&#39; di zoom avanti e indietro, e &#39;Alt + click&#39; per trasformare il cursore pennello in una gomma da cancellare. </li><li> Selezionare due aree di ~ 10 - 15 micronda 10-15 micron in alto a sinistra e in basso a destra dell&#39;immagine e identificare tutti i mitocondri all&#39;interno di queste aree per consentire il campionamento imparziale dei mitocondri in ogni set di dati. </li><li> Sul &#39;tele&#39;, osservare e tracciare i mitocondri in tutte le sezioni. Nota: I mitocondri sono piuttosto buio / densi organelli che appaiono, di dimensioni simili di diametro e vagamente cilindrica. Il creste unica formata dalla membrana interna sono facilmente distinguibili all&#39;interno di questo organello. </li><li> Una volta terminato con l&#39;analisi, fare clic destro sul area_list nella scheda spazio Z, selezionare &#39;Mostra in 3D&#39;. Questo lancerà il plugin visualizzatore 3D per visualizzare una ricostruzione 3D dell&#39;immagine tracciata. <ol><li> Per eseguire misurazioni del volume mitocondriale, selezionare oggetto in visualizzatore 3D, fare clic sulla scheda &#39;Modifica&#39; e selezionare &#39;Proprietà oggetto&#39;. La stima del volume mitocondriale è elencata insieme a diverse altre misure. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests. Emily K Benson is a paid employee of Renovo Neural Inc., and Grahame J Kidd serves as Scientific Director for 3DEM at Renovo Neural Inc., which is a commercial provider of serial block-face SEM services and analysis.

La complessità del sistema nervoso rappresenta una sfida significativa per ricostruire grandi volumi di tessuto e l&#39;analisi della morfologia e distribuzione di organelli come mitocondri con adeguata risoluzione. Più celle tra neuroni, oligodendrociti e astrociti con numerosi processi estesi in tre dimensioni interagiscono all&#39;interno del tessuto cerebrale 43. Poiché i mitocondri risiede sia nel soma di cellule e processi lontane, morfologia mitocondriale è estremamente pleomorfica nel sistema nerv...

I mitocondri sono organelli dinamici che cambiano la loro forma e la posizione a seconda delle esigenze spunti e cellulari, in stretta interazione con citoscheletro cellulare, e in risposta ad eventi cellulari come correnti di calcio nei neuroni 1. I mitocondri interagiscono anche con altri organelli cellulari ad esempio reticolo endoplasmatico, che a sua volta regola la loro dinamica e metabolismo 2. Morfologia mitocondriale mostra eterogeneità in diversi tipi di cellule ad esempio. la forma del organello varia da tubolare costituita dai fogli, sacchi e ovali 3. E &#39;stato dimostrato che mitocondriali fusione e fissione proteine ​​del ciclo possono regolare la posizione, dimensione, forma e distribuzione dei mitocondri 4. Inoltre, cambiamenti di forma mitocondriale sono associati a neurodegenerazione, plasticità neuronale, atrofia muscolare, la segnalazione di calcio, specie reattive dell&#39;ossigeno generazione così come la durata della vita e la morte cellulare implicando thacellule T specifiche per la morfologia mitocondriale è fondamentale per il mantenimento della normale funzione cellulare 5-11. Una delle principali funzioni bioenergetico dei mitocondri è generare adenosina trifosfato (ATP) eseguendo una serie di reazioni metaboliche che coinvolgono ripartizione completa dei nutrienti (cioè glucosio, acidi grassi o amminoacidi) tramite il ciclo TCA e OXPHOS percorsi 12. Il cervello umano costituisce solo il 2% del peso corporeo tuttavia consuma ~ 20% del totale dell&#39;energia prodotta che lo rende estremamente energia esigente organo 13. È quindi sorprendente che la disfunzione mitocondriale nell&#39;uomo conduce a un gran numero di manifestazioni neurologiche 14-17. Le mutazioni genetiche nei componenti OXPHOS che compromettono porta ATP generazione di disturbi mitocondriali 17,18, che sono gruppo clinicamente eterogeneo di disordini con una prevalenza di ~ 1: 5.000 individui, e una delle cause più comune di mdisturbi etabolic nei bambini e negli adulti. Deficit di ATP mitocondriale di derivazione colpisce di più sistemi di organo con gli organi che richiedono alta energia, come cervello, cuore e muscoli scheletrici essendo prevalentemente colpite in questi pazienti 14,17,18. Negli ultimi anni, diversi studi hanno fornito evidenza di disfunzione mitocondriale in entrambi i disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerative 15-17,19,20. Dal momento che i mitocondri sono essenziali e fondamentali per lo sviluppo e la funzione del cervello, è imperativo sviluppare protocolli in grado di analizzare i cambiamenti nel cervello mitocondriale morfologia, la struttura, le dimensioni, il numero e la distribuzione sotto entrambi gli stati sani e malati. Modelli murini con mitocondri mirati proteina fluorescente verde (GFP) sono stati prodotti di visualizzare i movimenti mitocondriali e la localizzazione nel cervello 21,22. Anche se questo è uno strumento estremamente utile per esaminare la motilità mitocondriale e distribuzione generale, ci sono alcuni inconvenienti che INCLUDe risoluzione limitata e sensibilità della microscopia a fluorescenza. Questi attributi rendono difficile rintracciare le relativamente piccole dimensioni mitocondri. Allo stesso modo, microscopia elettronica a trasmissione di serie è stato utilizzato con successo per visualizzare mitocondri sinaptica 23, ma questo metodo è molto tempo. La morfologia mitocondriale è noto per essere altamente dinamico come subiscono cicli di fissione e fusione continui, e nella maggior parte delle cellule mitocondri mantenere una rete altamente connessa 24-26. I neuroni sono altamente cellule con più dendriti e assoni estese, e mitocondri che formano una rete reticolare collegato nel corpo cellulare polarizzato può avere per separare come si fanno strada attraverso questi neuriti (Figura 1). Questo rende i mitocondri cerebrali estremamente vari per forma e dimensioni. Ad esempio, utilizzando la microscopia elettronica a scansione blocco faccia seriale (SBFSEM) tecnica, abbiamo precedentemente osservato che la differenza di volume o dimensioni mitochondr extrasinapticaia ai mitocondri presenti nei terminali nervosi può essere fino a sedici piega 27. Ci sono diversi approcci per l&#39;esecuzione di analisi del volume 28, che comprende una sezione di serie TEM 29, nastro automatizzata raccolta ultramicrotomo SEM 30, concentrati Ion Beam SEM 31, e SBFSEM 32. L&#39;analisi SBFSEM presenta vantaggi in quanto ha la risoluzione di fornire dati quantitativi sulla morfologica forma, dimensioni, distribuzione e numero di organelli come mitocondri nelle zone fino a 1 mm dal cervello. L&#39;operazione tecnica è anche il meno impegnativo, con l&#39;acquisizione dei dati e l&#39;analisi alla portata di molti laboratori biologici che non hanno precedenti esperienze EM. L&#39;avvento degli strumenti commerciali per la generazione di immagini di sezione simile seriali ha reso 3D analisi ultrastrutturale dei tessuti una tecnica di routine, che consente inoltre un&#39;analisi volumetrica imparziale in modo rapido e ripetibile 28 </sup&gt;. Il SBFSEM è stata descritta ed utilizzata nel campo della neurobiologia nel 2004 32, basato su un&#39;idea introdotta da Leighton nel 1981 33. Diversi studi da allora hanno stabilito questa tecnica come strumento di analisi ricostruzione dei circuiti neuronali 34. Inoltre, per molti progetti di dimensioni ridotte, che fornisce analisi di ricostruzione per identificare organelli cellulari 27,35-39. Poiché, le immagini acquisite vengono derivati ​​da bassa tensione elettroni retrodiffusione, nuovi protocolli di colorazione che combinano diverse tecniche note colorazione metalli pesanti sono stati sviluppati per aumentare la risoluzione 40. In questo lavoro, mettiamo a disposizione un protocollo per l&#39;utilizzo di immagini di microscopia elettronica 3D e l&#39;analisi volumetrica dei mitocondri cerebrali in base a metodi che sono stati usati in precedenza da noi e altri 38,39,41. I metodi di tessuti post-processing utilizzati erano come precedentemente descritto da Deerinck et al40.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>Jackson laboratory&amp;nbsp;</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone, tradename Fluriso</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tray</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>S65105&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly canula</td><td>Exel International</td><td>26704</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Filter (0.45 micron)</td><td>EMD Millipore</td><td>NC0813356</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome sectioning system</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>Vibratome 3000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Tannic Acid</td><td>EMS</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Ferrocyanide</td><td>J.T. Baker</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide 4% Solution</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide</td><td>EMS</td><td>21900</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A93100</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Hydroxide</td><td>Acros Organics</td><td>43731000</td><td></td></tr><tr><td>Lead Nitrate</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>EMbed-812 EMBEDDING KIT</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>Contains Embed 812&amp;nbsp; resin, DDSA, NMA, and DMP-30.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25% EM Grade</td><td>Polysciences Inc.</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Propylene Oxide</td><td>EMS</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Embedding Mold</td><td>EMS</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum specimen pin</td><td>EMS</td><td>70446</td><td></td></tr><tr><td>Colloidal Silver Liquid</td><td>EMS</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>Razor</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue (Loctite Gel Control)</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td>Hardware/craft stores carry this item</td></tr><tr><td>Conductive epoxy</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>16043</td><td></td></tr><tr><td>Scanning electron microscope</td><td>Zeiss</td><td>Sigma VP</td><td></td></tr><tr><td>In chamber ultramicrotome for SEM</td><td>Gatan Inc.</td><td>3View2</td><td>Can be designed for other SEMs</td></tr><tr><td>Trimming microscope for pin preparation</td><td>Gatan Inc.</td><td>supplied as part of 3View system</td><td></td></tr><tr><td>Low kV backscattered electron detector</td><td>Gatan Inc.</td><td>3V-BSED</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/ Fiji processing package&amp;nbsp;</td><td>ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015</td><td>&lt;a href=&quot;http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf&quot;&gt;http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;a href=&quot;http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf&quot;&gt;http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/TrakEM2&quot;&gt;http://fiji.sc/TrakEM2&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

analysis of brain mitochondria using serial block-face scanning electron microscopy

Il cervello umano è un alto organo consumare energia che si basa principalmente su glucosio come fonte di combustibile. Il glucosio è catabolizzata dai mitocondri cerebrali tramite percorsi glicolisi, acido tri-carbossilico (TCA) ciclo e fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per produrre energia cellulare sotto forma di adenosina trifosfato (ATP). Perdite di valore di produzione di ATP mitocondriale provoca disturbi mitocondriali, che presentano clinicamente con sintomi neurologici e miopatici prominenti. Difetti mitocondriali sono presenti in disturbi dello sviluppo neurologico (ad esempio disturbo dello spettro autistico) e disturbi neurodegenerativi anche (ad esempio, sclerosi laterale amiotrofica, il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson). Quindi, vi è un crescente interesse nel campo per l&#39;esecuzione di analisi 3D mitocondriale morfologia, struttura e distribuzione sotto entrambi gli stati sani e malattia. La morfologia mitocondriale cervello è estremamente variegato, con alcuni mitocondri specialmente quelliregione sinaptica essendo nell&#39;intervallo &lt;200 nm di diametro, che è inferiore al limite di risoluzione della microscopia ottica tradizionale. Esprimendo una proteina mitocondrialmente mirati verde fluorescente (GFP) nel cervello migliora in modo significativo la rilevazione organelli mediante microscopia confocale. Tuttavia, non supera i vincoli sulla sensibilità di rilevazione dei mitocondri relativamente piccole dimensioni senza sovra- saturazione delle immagini di grandi dimensioni mitocondri. Mentre microscopia elettronica a trasmissione di serie è stato utilizzato con successo per caratterizzare i mitocondri alla sinapsi neuronali, questa tecnica è notevole spreco di tempo soprattutto quando si confrontano campioni multipli. La tecnica di blocco faccia microscopia elettronica a scansione seriale (SBFSEM) comporta un processo automatizzato di sezionamento, blocchi di imaging di acquisizione dei tessuti e dei dati. Qui, forniamo un protocollo per eseguire SBFSEM di una regione definita da roditore cervello per ricostruire rapidamente e visualizzare la morfologia mitocondriale. questa tecnologianique potrebbe anche essere utilizzato per fornire informazioni accurate sul numero mitocondriale, volume, dimensione e distribuzione in una regione del cervello definito. Dal momento che la risoluzione dell&#39;immagine ottenuta è elevata (in genere sotto i 10 nm) possono essere rilevati anche gli eventuali difetti morfologici mitocondriali lordi.

Abbiamo dimostrato che il cervello morfologia e le dimensioni dei mitocondri è eterogeneo in diversi sotto-comparti neuronali. Microscopia confocale a bassa densità colture neuronali trasdotte con lentivirus che esprimono la proteina fluorescente verde mitocondri mirati ha dimostrato che i mitocondri che risiedono nel soma neuronale formano una rete reticolare, mentre quelli che risiedono in neuriti distali esibiscono una discreta morfologia allungata (Figura 1 AB). Ut...

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Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Analisi di Brain mitocondri Utilizzando Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K Views.  Virginia Tech Carilion Research Institute. Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle. 

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Ricerca

Neuroscienze

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Biochimica

Tecnica 3D per visualizzare le Cristae mitocondriali nelle cellule tumorali del pancreas

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a three-dimensional (3D) perspective, is critical for mechanistic studies. Electron microscopy (EM) offers good imaging depth and allows for the reconstruction of high-resolution image stacks to investigate the ultrastructural morphology of cellular organelles even at the nanometer scale; therefore, 3D reconstruction is gaining importance due to its incomparable advantages. Scanning electron microscopy (SEM) provides a high-throughput image acquisition technology that allows for reconstructing large structures in 3D from the same region of interest in consecutive slices. Therefore, the application of SEM in large-scale 3D reconstruction to restore the true 3D ultrastructure of organelles is becoming increasingly common. In this protocol, we suggest a combination of serial ultrathin section and 3D reconstruction techniques to study mitochondrial cristae in pancreatic cancer cells. The details of how these techniques are performed are described in this protocol in a step-by-step manner, including the osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) method, the serial ultrathin section imaging, and the visualization display.

Autore in primo piano: Una tecnica tridimensionale per la visualizzazione dei cambiamenti ultrastrutturali mitocondriali nelle cellule tumorali del pancreas  

This protocol describes how to reconstruct mitochondrial cristae to achieve 3D imaging with high accuracy, high resolution, and high throughput.

Una tecnica tridimensionale per la visualizzazione dei cambiamenti ultrastrutturali mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

Ricerca sul cancro

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) per lo studio delle spine dendritiche

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Un protocollo di immunocolorazione in situ per lo studio della malattia di Parkinson

Histological Examination of Mitochondrial Morphology in a Parkinson's Disease Model

Mitochondria play a central role in the energy metabolism of cells, and their function is especially important for neurons due to their high energy demand. Therefore, mitochondrial dysfunction is a pathological hallmark of various neurological disorders, including Parkinson's disease. The shape and organization of the mitochondrial network is highly plastic, which allows the cell to respond to environmental cues and needs, and the structure of mitochondria is also tightly linked to their health. Here, we present a protocol to study mitochondrial morphology in situ based on immunostaining of the mitochondrial protein VDAC1 and subsequent image analysis. This tool could be particularly useful for the study of neurodegenerative disorders because it can detect subtle differences in mitochondrial counts and shape induced by aggregates of &#945;-synuclein, an aggregation-prone protein heavily involved in the pathology of Parkinson's disease. This method allows one to report that substantia nigra pars compacta dopaminergic neurons harboring pS129 lesions show mitochondrial fragmentation (as suggested by their reduced Aspect Ratio, AR) compared to their healthy neighboring neurons in a pre-formed fibril intracranial injection Parkinson model.

Autore in primo piano: Stabilire un nuovo protocollo basato sulla fluorescenza per l'analisi della morfologia mitocondriale in vivo nella malattia di Parkinson

This study presents a method to analyze the morphology of mitochondria based on immunostaining and image analysis in mouse brain tissue in situ. It also describes how this allows one to detect changes in mitochondrial morphology induced by protein aggregation in Parkinson's disease models.

Esame istologico della morfologia mitocondriale in un modello di malattia di Parkinson

Mitochondria play a central role in the energy metabolism of cells, and their function is especially important for neurons due to their high energy ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique cristae-rich double membrane ultrastructure of this organelle is elegantly arranged to carry out multiple functions by partitioning biomolecules. Mitochondrial ultrastructure is intimately linked with various functions; however, the fine details of these structure-function relationships are only beginning to be described. Here, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle. Serial-section electron tomography may be adapted to study any cellular structure in three-dimensions.

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

In this protocol, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle.

3D ultrastruttura mitocondriale del muscolo di voli indiretti di Drosophila ha rivelato tramite tomografia dell'elettrone Serial-sezione

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Analisi di Brain mitocondri Utilizzando Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

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Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale

Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Una tecnica tridimensionale per la visualizzazione dei cambiamenti ultrastrutturali mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche

Una tecnica tridimensionale per la visualizzazione dei cambiamenti ultrastrutturali mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche

Una tecnica tridimensionale per la visualizzazione dei cambiamenti ultrastrutturali mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche

Microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) per lo studio delle spine dendritiche

Esame istologico della morfologia mitocondriale in un modello di malattia di Parkinson

Esame istologico della morfologia mitocondriale in un modello di malattia di Parkinson

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3D ultrastruttura mitocondriale del muscolo di voli indiretti di Drosophila ha rivelato tramite tomografia dell'elettrone Serial-sezione