Name: analysis of brain mitochondria using serial block-face scanning electron microscopy
Uploaded: 2016-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürleri Virginia Tech Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Dikkat: Bu protokolde kullanılan çeşitli parçaların kullanımında ve atarken aşırı önlemler alınmalıdır. Kullanmadan önce, kurumsal düzenlemeler ve iş sağlığı ve güvenliği uygulamaları yerel özellikle bir ağır metal ve radyoaktivite kaynağı ve kurşun nitrat hem uçucu ve son derece zehirli olan osmiyum tetroksit, uranil asetat, için, kurulmuş ve takip edilmelidir bir ağır metal zehir. Tiyokarbohidrazid (TCH) yanlış kullanılırsa, patlayıcı ve zehirli gazlar üretmek için ayrıştırmak. Birçok kurum bu reaktifler rutin kullanılmaktadır ve yardım sağlayabilir hangi bir EM çekirdek tesisine sahip olacak. Beyin Dokusu ve SBFSEM Görüntüleme 1. Hazırlık <ol><li> % 5 isoflura - 4 kullanarak - (4 aylık ~ 2) C57 siyah fare (C57BL / 6J suşu) genç uyutmakne kurumsal yönergeleri izleyerek. kas tonusu, istemli hareketlerin ve kuyruk tutam gibi caydırıcı uyaranlara yanıtları eksikliği kaybı izleyerek anesthetization onaylayın. </li><li> Bir diseksiyon tepsi üzerinde fare Pin ve ventral orta hat boyunca deri üzerinde bir kesi yapmak. fare göğüs kafesini maruz deride daha kesiler olun. diyaframı insizyon ve dikkatli bir şekilde kalpte ortaya çıkarmak için çevresi boyunca göğüs boşluğunu teşrih ve sağ atrium bir kesi yapmak. </li><li> Bir kelebek kanül kullanılarak, sol ventrikül kanüle. kan kaybı karaciğer renkte bir değişiklik ile teyit edilene kadar, fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.2 içinde 20 ml - transkardiyal 10 kullanılarak fare serpmek. Not: Karaciğer renk değişikliği kan kaybından kapsamını belirlemek için bir rehber olarak kullanılır. kırmızımsı kahverengi karaciğer renk değişiklikleri pembe soluk onaylayın. </li><li> % 2 Glutaraldehit 20 ml - transcardially 10 kullanarak fare serpmekaldehid ve% 4 paraformaldehid içinde hızlı bir şekilde beyin dokusu düzeltmek için, 0.10 M kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) içinde yapılır. Sabitleme kuyruk sertleşme gözlemleyerek tarafından izlenir. pH ayarı, ve su ile 100 ml hacmi oluşturmak için hidroklorik asit ilave, 80 ml su içinde bir sodyum kakodilat içinde 2.14 g çözülerek 0.10 M kakodilat tamponu (pH 7.2) hazırlayın: edin. </li><li> Perfüzyon sonrasında, fare decapitate 4 O ° C&#39;de 48 saat süre ile 0.10 M sodyum kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) ihtiva eden% 2 glutaraldehid ve% 4 paraformaldehid içinde fiksasyonu takiben beyin, teşrih </li><li> 48 saat sonra, bir vibratome kullanarak 400 mikron koronal kesitler yapmak ve daha sonra dikkatli bir şekilde diseksiyon mikroskobu 42 uyarınca (örneğin, hipokampus) beyindeki ilgili bölgeyi incelemek. Dikkatle doku Döşeme ve yönlendirmesini korunması için bir resim çekin. Not: SBFSEM doku boyama Mesaj işleme yöntemleri ağır metal boyama yöntemleri çeşitli birleştirirSipariş çözünürlüğü artırmak için ve Deerinck ve ark 40 tarafından daha önce geliştirilen yönteme dayanır. </li><li> glutaraldehid ile sabitlenmiş dokular 3 defa 5 dakika 0.1 M kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) içinde, her bir yıkama. </li><li> 0.1 M sodyum kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) içinde tannik asit çözülmesiyle% 0.1 tanik asit çözeltisi hazırlayın. çözülene kadar girdap ve gerekirse, 0.45 um&#39;lik bir filtreden filtre. </li><li> Oda sıcaklığında 60 dakika - Postfix&#39;i kakodilat olan dokular 30 1 mi reaktifi, inkübasyon yolu ile tanik asit,% 0.1 tamponlu. Not: kuluçka süresi doku büyüklüğüne bağlıdır, ancak 30 dakika çoğu dokuda en iyi şekilde çalışır. </li><li> dokular 3 defa 5 dakika kakodilat tamponu içinde her birinin (pH 7.2) yıkanır. </li><li> H2O damıtılmış 10 ml (dH 2 O) 0.3 g potasyum ferrosiyanat ve 0.86 g sodyum kakodilat eritin. Buz üzerinde potasyum ferrosiyanat çözüm tutun. Kullanımdan hemen önce,% 4 ozmiyum tetroksit (10 ml OsO 4) ekleyin. </li><li> % 2 os ile dokuları LekeBuz üzerinde 90 dakika süreyle MIUM-ferrosiyanür çözeltisi. DH 2 O 3 kez, 5 dakika her yıkayın </li><li> 10 ml dH 2 O 0.1 gr TCH çözerek% 1 tiyokarbohidrazid (TCH) çözümü hazırlayın tamamen çözünene kadar her 10 dakikada bir dönen 60 ° C&#39;de çözülür. TCH tutarken kurumasına yüksek sıcaklık veya izin çözüm metallerin kullanımını, ısınmayı önlemek için özen özellikle güvenlik önlemlerine uyunuz. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca taze hazırlanmış% 1 TCH olan örnekleri tedavi edin. DH 2 O 3 kez, 5 dakika her yıkayın </li><li> DH 2 O% 2 OsO 4% 4 seyreltilir, 1 saat süre ile inkübe edilerek% 2 sulu ozmiyum tetroksit ile leke dokular. DH 2 O. ile dokular 3 defa, 5 dakika her yıkayın </li><li> 4 ° C&#39;de dH 2 O içinde% 1 uranil asetat örnekleri O / N inkübe edin. </li><li> (Deerinck ve arkadaşları 40 tarafından tarif edildiği gibi) Walton kurşun aspartat çözeltisi hazırlayın. <ol><li> 250 ml dH 2 O 0.998 g L-aspartat çözülürpH 5.5 ulaşıncaya kadar ve sonra da damla damla 10 N potasyum hidroksit (KOH) ekleyin. pH ayarlaması sonra 30 dakika boyunca 60 ° C, asit stok ve ısı aspartik 10 ml talebi nitrat, 0.066 g ekleyin. </li></ol></li><li> DH 2 O dokuları yıkayın ve 60 ° C fırın içinde 30 dakika boyunca Walton kurşun aspartat boyasıyla inkübe edin. DH 2 O 3 kez, 5 dakika her yıkayın </li><li> % 100 etanol ile, ardından, her biri 5 dakika için% 20,% 50,% 75,% 85 ve% 95 etanol soğutulmuş solüsyonlar kullanılarak alkolün kademeli dizi 3 kez 10 dakika her biri numune kurutmak. Not: açılan etanol havadan su emer gibi yeni açılmış şişeden% 100 etanol kullanın ve başarısız olmasına gömme neden olur. Uzun inkubasyon büyük doku örnekleri ile gerekli olacaktır. </li><li> Yıkama örnekleri 2 kez 15 dakika propilen oksidin her. </li><li> (Süksinik anhidrit dodesenil) 25 ml reçine, 10.5 ml DDSA kullanarak plastik gömme reçine, 15.5 ml NMA (nadik metil anhidrit) ve 1 ml yapınDMP-30 (2,4,6-Tris dimetilaminometil fenol). sallayarak reçineyi karıştırın. Spin ve reçine kabarcıklar çözülene kadar bekletin. Not: Bu standart orta sertlikteki reçetedir. Elektron mikroskopisi (EM) plastik reçine diğer tipleri kullanılabilir ancak tüm reçineler SBFSEM için çalışmaz gibi önceden bir esansiyel olmayan kontrol numunesi ile test edilmesi gerekir. </li><li> - 10 saat, propilen oksit, yaklaşık 8 arasında bir süre boyunca buharlaşır, böylece 2 saat sonra, ilk başta daha sonra kapaksız kapaklı bir küçük şişe içinde, gömme reçine ve propilen oksidin 50 karışımı: 50 dokuların O / N inkübe edin. </li><li> 2 saat boyunca temiz şişelerde% 100 taze gömme reçine dokuları aktarın. </li><li> Düz kalıpların taze gömme reçinesi içinde yerleştirme örnekleri, kağıt etiketler basılmış ve 48 saat boyunca 60 ° C&#39;de bir fırında tedavi içeren. yaklaşık 1 saat sonra, tekrar doku yerleşimi ve hizalamayı kontrol ve gerekirse ayarlayın. </li><li> ilgi alanına örnekleri Trim ve gellin kullanarak bir alüminyum pim üzerine monteg siyanoakrilat superglue veya iletken epoksi reçine, daha sonra kolloidal gümüş ile kaplama alüminyum pin bir iletken yolu sağlamak için bloğun kenarlarına yapıştırın. </li><li> Bir in-bölme ultramicrotome evre ve düşük kV geri-saçılmalı elektron detektörü 32 ile donatılmış bir tarama elektron mikroskobu sistemi kullanılarak doku örneklerinin incelenmesi. Not: taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanın Araca ve site eğitim alın ve yetkili kullanıcı olmak. Alternatif olarak, küçük projeler için bir araştırmacı veya çekirdek tesisi ile işbirliği mümkün olabilir. SEM röntgen oluşturmak gibi Radyasyon eğitimi de gerekli olabilir. </li><li> örneklerin görüntü için aşağıdaki ayarları kullanın: 2.25 kV, 5 de - 10 nm / piksel çözünürlük, 80 arasında saha boyutları ile - x 250 mikron, y (diğer tarla mümkün boyutları) ve 50 dilim kalınlığı - 100 nm, 20 saat süre - 16 600 dilim - 250 toplamda. Not: Ayarlar farklı mikroskoplar arasında önemli ölçüde farklılık, indireysel örnekleri ve istenen çözünürlük. Bu ayarlar birçok örnekler için kolayca yorumlanabilir görüntüleri üretmek gerekir. </li></ol> 2. Görüntüleme DataSet Analizi Not: Resim J / Fiji yazılım veri kümesini analiz etmek için kullanılan ve TrakEM2 eklentisi dayanmaktadır edilir. Ön işleme aşamaları yazılımı kullanarak çeşitli yapılabilir ve geniş ya da deneyim düzeyine bağlı minör olabilir ve yığınlar aldı. açık kaynak kodlu yazılım kullanarak ana dönüşümler burada açıklanmıştır (1.50b ver ImageJ, FIJI 1 Ekim 2015 indir). <ol><li> yazılımda açılması ve menü Eşyaları Görüntü → Tipi → 8 bit seçerek orijinal patentli 16-bit görüntülerden 8 bit TIFF formatında görüntüleri dönüştürmek. <ol><li> Bu adım sırasında otomatik kontrast / parlaklık dönüşüm görüntüler için ideal değilse, 16-bit görüntüleri yeniden ve basın Görüntü Parlaklık / Kontrast → ayarla →. Tüm fotoğraflar için çalışan bir dizi seçin ve basın uygulayın. Sonra c gerçekleştirinonversion. Not: Bazı SEM&#39;ler, bu adım mikroskop üreticisi yazılımını gerektirebilir. </li><li> Nedeniyle dilimleri arasında kabul edilemez görüntü hareketi, Gerekirse (örn., Nedeniyle şarj drift), / kayıt görüntü yığınlarını (menü öğeleri Eklentiler Doğrusal StackAlignmentWithSIFT → → Kayıt) hizalayın. En kayıt yazılımı olarak, &quot;çeviri sadece&quot; modunda ziyade &quot;rijit gövde&quot; için ayarlayın. Birçok yaklaşımlar ve yazılım işe yarayabilir: Not birçok uygulama için SIFT kayıt plug-in eserleri ve sanal bir yığın sürümü var. <ol><li> Gerekirse, kayıt öncesi (Görüntü → canvassize → ayarlayın) ya da (Crop → Görüntü) ilgi alanına azaltmak tuval boyutunu büyütmek. Bazı sürüklenme veya meyletme oluşabilir ve diğer eklentileri veya yazılım çalışırken daha iyi sonuçlar doğurabilir: Not. Manuel seçenekleri de (örneğin. ImageJ / FIJI, Eklentiler → Kayıt → ManualLandmarkSelection) bulunmaktadır. </li></ol></li><li> desir Eğered, daha küçük, daha yönetilebilir boyuta ölçekli görüntüleri (örn.% 25) ImageJ (Görüntü → Ölçeği) kullanarak. </li></ol></li><li> yazılım, Dosya → ithalat → görüntü sırası başlatın ve ardından tiff dosyaları seçin. </li><li> (Boş) Yeni → TrakEM2 Dosya → seçerek eklenti başlatın. İki pencere açılacaktır; bir projeye ve area_lists yönetir ve diğer izleme yönetir ve tuval &quot;olarak adlandırılır. </li><li> tuval ithalatına sağ tıklama yaparak eklenti içine görüntü yığınını yükleyin. ithalat seçin ve ithalat yığının üzerine tıklayın. Pop-up seçeneklerinde sanal yığınlarının kutusunu işaretleyin. Not: Görüntü yığınları zaten yazılım açıldı rağmen, onlar da eklenti açılmalıdır. Sanal yığınları kutusu işaretlendiğinde ise bilgisayar daha sorunsuz çalışabilir. </li><li> Eşleşme oluşturulur ve yığın yüklendikten sonra, sağ eklenti pencerenin altında proje adı için tıklayın. Sağ şablon col &#39;yeni bir proje&#39; üzerine tıklayınUMN ve bu proje için &#39;yeni çocuk eklemek&#39; seçeneğini seçin. Sağ &#39;area_list&#39; seçmek için tekrar tıklayın. </li><li> Tuval üzerine sağ tıklayarak orijinal elektron mikroskobu ayarları ile kabul projenin Z ekseni ölçeği ayarlama, sonra ekranı tıklayın ve kalibrasyonu seçin. Ayrıca, eklenti penceresindeki tüm katmanları seçerek Z-ölçek ayarlamak, doğru ölçek Z ve kalınlığı seçmek için tıklatın. </li><li> Tıklayın ve &#39;proje&#39; ve proje tuval penceresinde &#39;Z boşluk&#39; sekmesi altında &#39;alan listeleri&#39; oluşturmak için bölüm nesneleri içine tüm &#39;çocuk&#39; sürükleyin. </li><li> &#39;Alan listesini seçin ve sağ seçin ve bir renk ayarlamak için tıklayın. Şimdi, elektron mikroskobu görüntüleri, mitokondri gibi nesneleri izlemek için boya fırçası aracını kullanın. Kullan &#39;Shift + tık&#39; kapalı bir daire içinde doldurmak için, &#39;Ctrl + kaydırma&#39; ve uzaklaştırmak için, ve bir silgi içine boya fırçası imlecini açmak için &#39;Alt + tık&#39;. </li><li> 15 mikron - ~ 10 iki alanları seçin10 tarafından - resmin sol üst köşesinde ve sağ alt köşesinde 15 mikron ve her veri kümesi içinde mitokondri tarafsız örnekleme izin vermek için bu alanlarda tüm mitokondri tespit. </li><li> &#39;Tuval&#39; Açık, gözlemlemek ve bölümler boyunca mitokondri iz. Not: Mitokondri benzer büyüklükteki oldukça karanlık / yoğun görünen organeller, çapı ve gevşek silindirik. iç zarı tarafından oluşturulan benzersiz kristalarında bu organel içinde kolaylıkla ayırt edilebilir. </li><li> izleme bittiğinde, sağ, Z uzay sekmesinin altında area_list tıklayın &#39;3D göster&#39; seçeneğini seçin. Bu takip görüntünün 3 boyutlu rekonstrüksiyon görüntülemek için 3D görüntüleyici eklenti başlatacak. <ol><li> mitokondriyal hacim ölçümleri, 3D görüntüleyici seçin nesne gerçekleştirmek için, &#39;Düzenle&#39; sekmesine tıklayın ve &#39;Object Properties&#39; seçiniz. mitokondriyal hacim tahmini birkaç diğer ölçümlerle birlikte listelenir. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests. Emily K Benson is a paid employee of Renovo Neural Inc., and Grahame J Kidd serves as Scientific Director for 3DEM at Renovo Neural Inc., which is a commercial provider of serial block-face SEM services and analysis.

Sinir sisteminin karmaşıklığı, yeterli çözünürlüğe sahip mitokondri gibi büyük doku hacimleri yeniden ve morfolojisi ve organellerin dağılımı analiz önemli bir sorun teşkil etmektedir. Nöronlar, oligodendrosit ve üç boyutlu olarak uzatılmış çok sayıda süreçlerle astrositlerin dahil olmak üzere birden hücreler, beyin dokusu 43 içinde etkileşimde. Mitokondri hücreleri ve uzak süreçlerin soma hem de bulunduğu için, mitokondriyal morfolojisi sinir sistemi (Şekil 1)</...

Mitokondri hücre iskeleti ile sıkı etkileşim içinde, onların şekil ve hücresel ipuçları ve ihtiyaçlarına bağlı olarak konumunu değiştirmek dinamik organelleri vardır ve bu tür nöronlar 1 kalsiyum kanal akımlarının gibi hücresel olaylara yanıt olarak. Diğer hücre organelleri sırayla kendi dinamiklerini ve metabolizmasını 2 düzenleyen endoplazmik retikulum, örneğin ile mitokondri de etkileşim. Mitokondriyal morfolojisi yani farklı hücre tiplerinde heterojenitesini gösterir. organelle şekli bu levhalar, çuvallar ve oval 3 oluşan için boru şeklinde değişir. Mitokondriyal füzyon ve fisyon döngüsü proteinleri yer, boyut, şekil ve mitokondri 4 dağılımını düzenler gösterilmiştir. Ayrıca, mitokondriyal şekil değişimleri nörodejenerasyon, nöronal plastisite, kas atrofisi, kalsiyum sinyali, reaktif oksijen türleri üretimi gibi ömrü ve hücre ölümü karıştığı THA ile ilişkilidirT hücre spesifik mitokondriyal morfolojisi normal hücresel fonksiyonun 5-11 bakımı için kritiktir. Mitokondri önemli bioenergetic fonksiyonu TCA döngüsü yoluyla tam besin dağılımı (yani, glükoz, yağlı asitler ya da amino asitler) içerir ve OXPHOS 12 geçiş yolu, metabolik reaksiyonlar bir dizi yürüterek adenosin trifosfat (ATP) üretmektir. İnsan beyni vücut ağırlığının sadece% 2 ancak ~ o organı 13 zorlu bir derece enerji verme üretilen toplam enerjinin% 20&#39;sini tüketir oluşturmaktadır. İnsanlarda mitokondriyal fonksiyon bozukluğu, nörolojik belirtiler 14-17 çok sayıda yol açtığı şaşırtıcı değildir. Genetik ~ 1 bir prevalans ile bozuklukların klinik heterojen bir grup olan mitokondriyal hastalıkların 17,18, ATP nesil açar bozan OXPHOS bileşenleri mutasyonlar: 5.000 birey ve m en yaygın nedenlerinden biridirçocuklarda ve erişkinlerde etabolic bozukluklar. Mitokondri türevi ATP açığı, beyin, kalp ve iskelet kasları ağırlıklı bu hastalarda 14,17,18 de etkilenen gibi yüksek enerji gerektiren organları ile çoklu organ sistemleri etkiler. Son yıllarda, birçok çalışma nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların 15-17,19,20 hem mitokondriyal disfonksiyon için kanıtlar sağlamıştır. mitokondri temel ve beyin gelişimi ve işlevi için kritik olduğundan, hem sağlıklı ve hastalıklı devletlerin altında beyin mitokondriyal morfoloji, yapısı, büyüklüğü, sayısı ve dağılımında değişikliklere analiz protokolleri geliştirmek zorunludur. Mitokondriyal hedeflenen yeşil floresan proteini (GFP) sıçan modelleri beyin 21,22 mitokondriyal hareketleri ve lokalizasyon görselleştirmek için üretilmiştir. Bu mitokondriyal hareketliliği ve genel dağılımını incelemek son derece yararlı bir araç olsa da, includ bazı dezavantajları vardırE sınırlı çözünürlük ve floresan mikroskobu duyarlılığı. Bu nitelikler zor nispeten küçük ölçekli mitokondri izlemek için yapmak. Benzer şekilde, seri transmisyon elektron mikroskobu başarıyla sinaptik mitokondri 23 görüntülemek için kullanılan, ancak bu yöntem çok zaman alıcı değil. Mitokondriyal morfoloji, sürekli fizyon ve füzyon döngülerine tabi olarak son derece dinamik olduğu bilinmektedir ve çoğu hücrelerde mitokondri son derece bağlı bir ağ 24-26 korumak olduğunu. Nöronlar çok onlar bu neurites yollarını (Şekil 1) yapmak gibi ayrı gerekebilir birden dendritler ve genişletilmiş akson ve hücre gövdesinde bağlı bir retiküler ağ oluşturmak mitokondri hücreleri polarize edilir. Bu boyut ve şekil son derece çeşitli beyin mitokondri yapar. Örneğin, bir seri bloğu yüz tarama elektron mikroskobu kullanılarak (SBFSEM) tekniği, daha önce gözlenen extrasynaptic mitochondr hacmi ya da boyut olarak farklılıkon altı 27 kat olarak sinir uçlarında bulunan mitokondri ia kadar olabilir. Sesi gerçekleştirmek için çeşitli yaklaşımlar vardır ultramicrotome SEM 30 toplama seri bölüm TEM 29, otomatik bant içeren, 28 analizleri, iyon ışın SEM 31 ve SBFSEM 32 duruldu. SBFSEM analizi, beyin 1 mm&#39;ye kadar alanda mitokondri gibi morfolojik şekil, boyut, dağıtım ve organellerin sayısal verisi sağlamak için çözünürlüğü sahip olduğu avantajlara sahiptir. Teknik çalışma bir önceki EM deneyim eksikliği birçok biyolojik laboratuvarlar yetenekleri dahilinde veri toplama ve analizi ile, aynı zamanda en az talep ediyor. Seri bölüm benzeri görüntüler üretmek için ticari araçların gelişi dokuların 3D ultrastrüktürel analiz yapmıştır ayrıca hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde 28 tarafsız bir hacimsel analizini veren bir rutin teknik, </&gt; Sup. SBFSEM sonra ilk nöronal devrenin 34 rekonstrüksiyonu analizinde önemli bir araç olarak bu tekniği kurduk 1981 yılından bu yana 33. Birden çalışmalarda Leighton tarafından tanıtılan bir fikrine dayanan, 2004 32 nörobiyoloji alanında tanımlanan ve kullanılmıştır. Ayrıca, birçok küçük ölçekli projeler için, hücresel organellere 27,35-39 belirlemek için yeniden analiz sağlar. Bu yana, edinilen görüntüler alçak gerilim geri saçılım elektron türetilmiştir, bilinen farklı ağır metal boyama tekniklerini birleştiren yeni boyama protokolleri çözünürlüğü 40 artırmak için geliştirilmiştir. Bu yazıda, 3D elektron mikroskopi görüntüleme ve daha önce bize ve diğerleri 38,39,41 tarafından kullanılmış olan yöntemlere dayalı beyin mitokondri hacimsel analizini kullanan bir protokol sağlar. Doku sonrası işleme yöntemleri, daha önce Deerinck ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir kullanılan40.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>Jackson laboratory&amp;nbsp;</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone, tradename Fluriso</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tray</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>S65105&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly canula</td><td>Exel International</td><td>26704</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Filter (0.45 micron)</td><td>EMD Millipore</td><td>NC0813356</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome sectioning system</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>Vibratome 3000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Tannic Acid</td><td>EMS</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Ferrocyanide</td><td>J.T. Baker</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide 4% Solution</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide</td><td>EMS</td><td>21900</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A93100</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Hydroxide</td><td>Acros Organics</td><td>43731000</td><td></td></tr><tr><td>Lead Nitrate</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>EMbed-812 EMBEDDING KIT</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>Contains Embed 812&amp;nbsp; resin, DDSA, NMA, and DMP-30.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25% EM Grade</td><td>Polysciences Inc.</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Propylene Oxide</td><td>EMS</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Embedding Mold</td><td>EMS</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum specimen pin</td><td>EMS</td><td>70446</td><td></td></tr><tr><td>Colloidal Silver Liquid</td><td>EMS</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>Razor</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue (Loctite Gel Control)</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td>Hardware/craft stores carry this item</td></tr><tr><td>Conductive epoxy</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>16043</td><td></td></tr><tr><td>Scanning electron microscope</td><td>Zeiss</td><td>Sigma VP</td><td></td></tr><tr><td>In chamber ultramicrotome for SEM</td><td>Gatan Inc.</td><td>3View2</td><td>Can be designed for other SEMs</td></tr><tr><td>Trimming microscope for pin preparation</td><td>Gatan Inc.</td><td>supplied as part of 3View system</td><td></td></tr><tr><td>Low kV backscattered electron detector</td><td>Gatan Inc.</td><td>3V-BSED</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/ Fiji processing package&amp;nbsp;</td><td>ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015</td><td>&lt;a href=&quot;http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf&quot;&gt;http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;a href=&quot;http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf&quot;&gt;http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/TrakEM2&quot;&gt;http://fiji.sc/TrakEM2&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

analysis of brain mitochondria using serial block-face scanning electron microscopy

İnsan beyni ağırlıklı bir yakıt kaynağı olarak glikoz dayanan bir yüksek enerji tüketen organdır. Glukoz adenosin trifosfat (ATP) şeklinde hücresel enerji üretmek için glikoliz, tri-karboksilik asit (TCA) döngüsü ve oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) yollar ile beyin mitokondrilerde katabolize edilir. mitokondriyal ATP üretimi düşüklüğü belirgin nörolojik ve myopatik semptomlar ile klinik mevcut mitokondriyal bozukluklar neden olur. Mitokondrial kusurlar da nöro bozuklukları (örneğin otizm spektrum bozukluğu) ve nörodejeneratif bozukluklarda mevcut (örneğin, amiyotrofik lateral skleroz, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları). Böylece, sağlıklı ve hastalık durumları hem altında mitokondriyal morfolojisi, yapısı ve dağıtım 3D analizini gerçekleştirmek için alanında artan bir ilgi var. Beyin mitokondriyal morfoloji özellikle bazı mitokondri ile bu son derece çeşitlidirsinaptik bölge geleneksel ışık mikroskobu çözünürlüğü sınırının altındadır &lt;200 nm çaplı aralığında olmak. beyinde mitokondriyal hedeflenen yeşil floresan proteinini (GFP) ifade anlamlı konfokal mikroskopi ile organel algılama arttırır. Ancak, büyük ölçekli mitokondri görüntüleri oversaturating olmadan nispeten küçük ölçekli mitokondri saptanmasının duyarlılığı üzerindeki kısıtlamaları aşmak değil. seri geçirimli elektron mikroskobu başarıyla nöronal sinaps mitokondri karakterize etmek için kullanılmış olsa da, bu teknik son derece zaman alıcı birden fazla numune karşılaştırırken özellikle olduğunu. Seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBFSEM) tekniği, doku ve veri toplama görüntüleme blokları kesit bir otomatik süreç gerektirir. Burada, hızla yeniden ve mitokondriyal morfolojisi görselleştirmek için kemirgen beyin tanımlanmış bir bölgenin SBFSEM gerçekleştirmek için bir protokol sağlar. bu teknolojinique da tanımlanan bir beyin bölgesi mitokondriyal sayısı, hacmi, boyutu ve dağılımı üzerindeki doğru bilgi temin etmek için kullanılabilir. Elde edilen görüntü çözünürlüğü (genellikle 10 nm altında) yüksek olduğundan herhangi bir brüt mitokondriyal morfolojik bozukluklar da tespit edilebilir.

Beyin mitokondriyal morfolojisi ve boyutu farklı nöronal alt bölümlerinde heterojen olduğunu göstermektedir. Lentivirüs mitokondriyal hedefli yeşil flüoresan protein ifade ile dönüştürülmüş düşük yoğunluklu nöronal kültürlerinde mikroskopisi uzak neurites kalanların ayrı uzatılmış morfoloji (Şekil 1 AB) sergilemek ise nöronal soma ikamet eden mitokondri, bir retiküler ağ oluştururlar olduğunu gösterdi. SBFSEM teknik kullanılarak, mitok...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

analysis-brain-mitochondria-using-serial-block-face-scanning-electron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K Görüntüleme.  Virginia Tech Carilion Research Institute. Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle. 

Video: Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Nörobilim

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Biyokimya

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Cristae'yi Görselleştirmek için 3D Teknik

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a three-dimensional (3D) perspective, is critical for mechanistic studies. Electron microscopy (EM) offers good imaging depth and allows for the reconstruction of high-resolution image stacks to investigate the ultrastructural morphology of cellular organelles even at the nanometer scale; therefore, 3D reconstruction is gaining importance due to its incomparable advantages. Scanning electron microscopy (SEM) provides a high-throughput image acquisition technology that allows for reconstructing large structures in 3D from the same region of interest in consecutive slices. Therefore, the application of SEM in large-scale 3D reconstruction to restore the true 3D ultrastructure of organelles is becoming increasingly common. In this protocol, we suggest a combination of serial ultrathin section and 3D reconstruction techniques to study mitochondrial cristae in pancreatic cancer cells. The details of how these techniques are performed are described in this protocol in a step-by-step manner, including the osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) method, the serial ultrathin section imaging, and the visualization display.

Yazar Spotlight: Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik  

This protocol describes how to reconstruct mitochondrial cristae to achieve 3D imaging with high accuracy, high resolution, and high throughput.

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

Kanser Araştırmaları

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Parkinson Hastalığı Çalışması için Yerinde İmmün Boyama Protokolü

Histological Examination of Mitochondrial Morphology in a Parkinson's Disease Model

Mitochondria play a central role in the energy metabolism of cells, and their function is especially important for neurons due to their high energy demand. Therefore, mitochondrial dysfunction is a pathological hallmark of various neurological disorders, including Parkinson's disease. The shape and organization of the mitochondrial network is highly plastic, which allows the cell to respond to environmental cues and needs, and the structure of mitochondria is also tightly linked to their health. Here, we present a protocol to study mitochondrial morphology in situ based on immunostaining of the mitochondrial protein VDAC1 and subsequent image analysis. This tool could be particularly useful for the study of neurodegenerative disorders because it can detect subtle differences in mitochondrial counts and shape induced by aggregates of &#945;-synuclein, an aggregation-prone protein heavily involved in the pathology of Parkinson's disease. This method allows one to report that substantia nigra pars compacta dopaminergic neurons harboring pS129 lesions show mitochondrial fragmentation (as suggested by their reduced Aspect Ratio, AR) compared to their healthy neighboring neurons in a pre-formed fibril intracranial injection Parkinson model.

Yazar Gündemi: Parkinson Hastalığında İn Vivo Mitokondriyal Morfoloji Analizi için Yeni Bir Floresan Tabanlı Protokol Oluşturma

This study presents a method to analyze the morphology of mitochondria based on immunostaining and image analysis in mouse brain tissue in situ. It also describes how this allows one to detect changes in mitochondrial morphology induced by protein aggregation in Parkinson's disease models.

Bir Parkinson Hastalığı Modelinde Mitokondriyal Morfolojinin Histolojik İncelemesi

Mitochondria play a central role in the energy metabolism of cells, and their function is especially important for neurons due to their high energy ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique cristae-rich double membrane ultrastructure of this organelle is elegantly arranged to carry out multiple functions by partitioning biomolecules. Mitochondrial ultrastructure is intimately linked with various functions; however, the fine details of these structure-function relationships are only beginning to be described. Here, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle. Serial-section electron tomography may be adapted to study any cellular structure in three-dimensions.

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

In this protocol, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle.

3D mitokondriyal Ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas seri-bölüm elektron tomografi tarafından ortaya

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik

Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Bir Parkinson Hastalığı Modelinde Mitokondriyal Morfolojinin Histolojik İncelemesi

Bir Parkinson Hastalığı Modelinde Mitokondriyal Morfolojinin Histolojik İncelemesi

Bir Parkinson Hastalığı Modelinde Mitokondriyal Morfolojinin Histolojik İncelemesi

3D mitokondriyal Ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas seri-bölüm elektron tomografi tarafından ortaya