We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).

試薬の調製<ol><li>細胞溶解緩衝液を調製し（50mMトリス、pHが8.8、100mMのNaCl、5mMのMgCl 2、0.5％NP-40）。補足2 mMのDTT、1×完全プロテアーゼカクテル、そして使用前に250 IU / mlのベンゾナーゼ。 </li><li>ペレットバッファー（20 mMトリス、pHが8.0、15のMgCl 2）を準備します。補足2 mMのDTT、使用前に1×完全プロテアーゼカクテルと250 IU / mlのベンゾナーゼ。 </li><li> 3倍沸騰バッファ（6％SDS、20 mMトリス、pHは8.0）を準備します。使用前に150mMのDTTを補います。 </li><li>マイクロプレート蛍光リーダーを用いたアッセイのための低蛍光DMEM培地を準備します。 25 mMグルコース、0.4 mMグリシン、0.4 mMのアルギニン、0.2 mMのシステイン、4.0 mMグルタミン、0.2 mMヒスチジン、0.8 mMのイソロイシン、0.8mMのロイシン、0.8 mMのリシン、0.2 mMのメチオニン、0.4 mMのフェニルアラニン、0.4 mMのセリン、0.8ミックスmMのスレオニン、0.078 mMのトリプトファン、0.4mMのチロシン、0.8 mMのバリン、1.8 mMのCaCl 2を、0.81 mMのMgSO 4を、5.33のKCl、44.0ミリモルのNaHCO 3、110 mMのNaClを、0.9 mMのNaH 2 PO 4。 pH7.4にHClまたはNaOHを用いて溶液のpHを調整します。濾過により培地を滅菌します。 注：この培地は、Fe（NO 3）3、ビタミンやフェノールレッドが省略されていることを除いて、高グルコースを標準DMEM培地のコンポーネントが含まれています。フェノールレッド、著しく蛍光信号21の検出を妨害する正規のDMEM培地中でリボフラビンおよびピリドキサール。これらの成分を含まない培地は、成功した生細胞のGFPイメージングのために重要です。媒体は、冷蔵保存された12ヶ月間安定です。 </li></ol> Atxn1 82Q GFPの2分解アッセイ<ol><li>プレート約10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したDMEM培地で35mmのプレートに3×10 5 HeLa細胞、O / N培養細胞は、トランスフェクションの時点で40〜60％のコンフルエンスまで増殖した後、そのように。 注：必要なプレートの数は、時間点の数に基づいており、処置D下記の傍接しました。 </li><li> Atxn1 82Q-GFP /のpRK5プラスミド0.3μgのでトランスフェクトしたHeLa細胞を用いて各ウェルトランスフェクション試薬に、製造元の指示9に従って。 DNAとトランスフェクション試薬を含むマスタートランスフェクション混合物を作成し、各ウェルのためにそれを分取。 </li><li> 4-5時間後、トランスフェクション、励起波長450〜490ナノメートルとのGFP発現のための倒立蛍光顕微鏡下で生きた細胞を調べます。撮影後にインキュベーターに戻し、細胞を返します。 注：この時点では核内の両方の拡散GFPシグナルおよびGFPシグナルの小さなスペックルを守ってください。 </li><li>真空吸引によって培地を除去し、50μg/ mlののCHXを含む2ミリリットルの新鮮なDMEMを追加します。収穫前のCHXで0、4、8、12、16時間細胞を処理します。プロテアソーム分解を調べるために、対照として16時間処理1プレートにプロテアソーム阻害剤MG132（10μM）を含みます。 </li><li>各時点で、細胞のプレートを収穫。真空吸引ANによって培地を除去3 mlの氷冷1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回プレートを洗浄Dはドライアイス上でプレートをスナップ凍結。 </li><li>最終時点（16時間）した後、氷冷細胞溶解緩衝液150μlの中に（すべての時点から）凍結細胞をこすり、30分間氷上でインキュベートしました。 </li><li> 4℃で15分間、17000×gで卓上遠心機で細胞溶解物を遠心。 </li><li>ピペットを用いて別のチューブに、NP-40溶性（NS）タンパク質を含有する上清を、転送します。 注：必要に応じて、Bradfordアッセイによりタンパク質濃度を測定するために上清を使用してください。 </li><li>優しくペレットを乱すことなくチューブに約200μlの1×PBSを添加することにより、ペレットをすすぎます。慎重に真空吸引またはピペットでPBSを削除します。氷上で15〜30分間インキュベートし、150μlの氷冷細胞ペレットをバッファに再懸濁します。 注：再懸濁したペレット画分は、NP-40不溶性（NI）のタンパク質が含まれています。 DIAGについては、 図1Bを参照してください。洗剤分画のラム。 </li><li>ペレットから再懸濁NS画分とNP-40不溶性（NI）の画分に3回沸騰バッファー75μlのを追加します。 5分間のヒートブロック上で95℃でサンプルを加熱します。 注：塊は、NP-40不溶性画分に加熱した後に溶解し、サンプルが明らかになるだろう。 </li><li>ゆでたNSとNIのアリコートにSDSゲルローディングバッファーを追加します。 SDS-PAGEゲルにすべての時点から採取したサンプルを等量ロードします。時間0注で採取した試料から約20μgのNSのに対応してロードされたボリューム：NS、ならびにNI派からSDS-可溶性（SS）タンパク質は、分離ゲルのSDSすることで解決できます。これとは対照的に、NI画分からSDS耐性（SR）凝集体はゲルローディングウェル（ 図1B）で立ち往生しています。ウェスタンブロット検出を改善するために、NIの2倍量をロードすることができます。 </li><li>抗GFP抗体を用いたウエスタンブロットおよび増強化学発光（ECL）によりNSとSS Atxn1 82Q-GFPを検出します。 注：このプロトコルを使用する場合SS画分中Atxn1 82Qは、一般的に以下NS画分と比較されます。長いECL露光は、最適な信号のために必要とされます。 </li><li>ドットブロット装置（ 図1B）を使用してフィルタ遅延アッセイによりペレット画分からSR Atxn1 82Qを調べます。簡単に言うと、0.2μmのセルロースアセテート膜を保持するドットブロット装置を設定します。ドットブロット装置の各ウェルにゆでNIの負荷80-120μlの。 注：SR凝集体のわずかな量が細胞内で形成されているように、ドットブロットアッセイのために、ウェスタンブロット分析のために使用されるNS画分の容積の約10〜15倍であるSR画分の量を読み込みます。 <ol><li>真空によって膜を通してサンプルを濾過した後、膜に付着Atxn1 82Q-GFP凝集体は、抗GFPは9,12,22を免疫ブロッティングすることによって検出することができます。 注：フィルタ遅延アッセイの詳細については、9,12,22、前のレポートを参照してください。この手順はオプションですSR Atxn1 82Qは、このプロトコルで説明する短いトランスフェクションを、以下SSとNS画分に比べて最小限であるため。また、SR Atxn1 82Qのレベルが大幅にCHXチェイス（ 図2B）を介して同じまま。しかし、SS Atxn1 82Qの量は、最初の実験で任意の薬物治療や遺伝子発現のための時間をかけて影響を受けているかどうかを検討することが重要です。 SSタンパク質種は、ウェスタンブロットによって検出することができるSDS-PAGEゲルローディングウェルにとどまります。しかし、この方法はあまり敏感であり、多くの変数の結果（ 図1B）を生成します 。 </li></ol></li></ol> SDS-PAGEおよびウエスタンブロットを使用してNLS-ルシフェラーゼGFP 3.分解アッセイ<ol><li>プレート約10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したDMEM培地で35mmのプレートに3×10 5 HeLa細胞。 O / N培養した後、40から60パーセントの合流は、トランスフェクションの時点で到達しました。必要なプレートの数は、Tの数に基づいていますIMEポイントと治療は、以下に説明します。 </li><li> 1.0μgのNLSルシフェラーゼ-GFP /のpRK5プラスミドでトランスフェクトしたHeLa細胞を用いて各ウェルトランスフェクション試薬に、製造元の指示9に従って。各ウェルのアリコートのためのDNAとトランスフェクション試薬を含むマスタートランスフェクションミックスを作成します。 </li><li> （15時間程度）O / Nトランスフェクションした後、励起波長450〜490ナノメートルとのGFP発現のための倒立蛍光顕微鏡下で生きた細胞を調べます。撮影後にインキュベーターに戻し、細胞を返します。 注：拡散処理核GFPシグナルは、細胞（70％）の大部分で観察することができます。細胞の小さな割合（5％）は、核凝集体を持っています。 </li><li>真空吸引によって培地を除去し、50μg/ mlののCHXを含む2ミリリットルの新鮮なDMEMを追加します。収穫前のCHXで0、1.5、3、4.5および6時間細胞を処理します。プロテアソーム分解を調べるために、対照として6時間処理1のプレートに追加のプロテアソーム阻害剤MG132（10μM）を含みます。 </li><li>各時点で、細胞のプレートを収穫。真空吸引によって培地を除去し、3ミリリットルの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回プレートを洗浄します。ドライアイス上でプレートをスナップ凍結。 </li><li>最後の時点（6時間）が終了した後に、すべての時点で凍結細胞を氷冷細胞溶解緩衝液150μlの中に掻き取り、氷上で30分間インキュベートします。 </li><li>最終的に2％のSDSの濃度および50mMのDTTのための全細胞溶解物をSDSゲルローディングバッファーを追加します。 95℃で5分間ヒートブロック上でサンプルをインキュベートします。 </li><li> SDS-PAGEと抗GFP抗体を用いたウェスタンブロットによってNLS-ルシフェラーゼGFPを分析します。 SDS-PAGEゲルにすべての時点から採取したサンプルを等量ロードします。ロードされたボリュームは、約20μgの時間0で採取した試料からの全細胞溶解物のに対応しています。 </li></ol>蛍光マイクロプレートリーダーを使用したNLS-ルシフェラーゼ-GFPの4リアルタイム分解アッセイ<ol><li>種子約1×10 4透明な底を有する黒色96ウェル組織培養プレートに、HeLa細胞。 O / N培養した後、百分の50から70までの合流は、トランスフェクションの時点で到達しました。 注：完全に懸濁したHeLa細胞を含有する培地の60μlの各ウェルに直接播種します。播種後前後に追加の媒体や岩板を追加しないでください、そうでなければ細胞が不均一に分布することができます。 </li><li>各ウェル使用してトランスフェクション試薬へのNLSルシフェラーゼ-GFP /のpRK5プラスミド9の0.05〜0.1μgのでトランスフェクトしたHeLa細胞を製造業者の指示に従って。 DNAとトランスフェクション試薬を含むマスタートランスフェクション混合物を作成し、各ウェルのためにそれを分取。細胞との3つのウェルを、各処理条件の背景蛍光信号のための対照として役立つDNAでトランスフェクトされていません。 注：トランスフェクションの変動を低減する別の方法は、播種前に細胞をトランスフェクトすることです。しかし、細胞の大部分は、ミスフォールドタンパク質をトランスフェクトしましたsが添付またはこのメソッドを使用して減少した生存率を示すことができません。いくつかの細胞が毒性ミスフォールドタンパク質を発現させる際に、トリプシン消化により生じる応力に耐えられないことがありそうです。その結果、全体的な蛍光シグナルが大幅に低減されます。 </li><li>トランスフェクション後20-24時間、励起波長450〜490ナノメートルとのGFP発現のための倒立蛍光顕微鏡下で生きた細胞を調べます。 </li><li>真空吸引によって培地を除去します。各ウェルにPBS 1×約200μlを添加し、その後DMEM培地の残留量を除去するために、それを吸引します。 </li><li> 5％FBSおよび50μg/ mlのCHXで低蛍光DMEM培地60μlのを追加します。プロテアソーム分解を調べるために、サンプルの一組に付加的なプロテアソーム阻害剤MG132（10μM）を含みます。各治療/条件のために、ウェルの三重を設定します。 注：のfluoの低下を引き起こす可能性が他の要因を排除することが重要であるため、MG132処理は、プロテアソームによる分解のためのコントロールとして含まれています細胞死および蛍光消光含むrescence信号。 </li><li> CHXを追加した後、蛍光プレートリーダーですぐにGFPの蛍光シグナルを測定します。 注：ソフトウェアの測定設定は、 表1に示します。 </li><li>プレートにまで8-10時間ごとに時間をお読みください。お読みになった後、細胞培養インキュベーターにバックプレートを返します。 </li><li>スプレッドシートファイルとしてデータをエクスポートします。各だけでなく、蛍光強度をマルチ読み込みの平均値を使用してください。各グループにおける時間0の平均値を、各データ点の値を正規化します。 図4Aおよび図4B、 図5、右パネルに示すように、時間をかけて正規化された蛍光強度をプロットします。 </li><li>反復測定23との双方向ANOVAを使用して、2つの条件の間の分解速度の統計分析を実行します。 注：この分析では、「蛍光強度」とは、「treatm一方、従属変数でありますENT条件」と「時間」は、2つの要因である。その代わりに、個々の時点でデータを比較する、双方向ANOVA反復測定と全時間経過にわたって2つの治療群間の差を分析します。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

ミスフォールドタンパク質の分解を調節するメカニズムは、細胞タンパク質の恒常性を維持するために必須であり、それらはおそらく神経変性疾患および他のタンパク質の誤った折りたたみに起因する疾患を治療するための価値ある薬物標的を表します。ここでは、ミスフォールドタンパク質の分解を調べるアッセイは、例として、病原Atxn1タンパク質（Atxn1 82Q）および核局在化ルシフェラ?...

タンパク質は、細胞中で最も豊富な巨大分子であり、それらは事実上すべての生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。ほとんどのタンパク質の生物学的活性は、それらの中に折り畳み、そして、天然の三次元構造を維持することが必要です。異常なコンフォメーションを有するタンパク質は、それらの正常な機能を失うだけでなく、頻繁に他のタンパク質の機能を損ない、細胞1,2に対して毒性である可溶性オリゴマー種または凝集体を形成しません。タンパク質の誤った折り畳みに対抗するために、細胞は、ミスフォールドタンパク質3を除去分子鎖両その天然のコンフォメーションに到達するために折り畳まれていないまたは部分的に折り畳まれたポリペプチドを助けるシャペロン、および分解経路を利用します。複雑さと折り処理の確率的な性質を考えると、タンパク質ミスフォールディングは不可避であり、突然変異、生合成誤差、および翻訳後ダメージ1の場合には逆にしなくてもよいです。したがって、細胞は、最終的degradatに依存しますイオン経路は、それらのタンパク質の品質を維持します。 細胞タンパク質の品質管理（PQC）システムの重要性は、癌、糖尿病、アルツハイマー病などの多くの神経変性疾患、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病（HD）を含む、タンパク質の誤った折りたたみに起因する疾患の有病率によって強調され、そして脊髄小脳失調（SCA）4,5。例えば、腫瘍抑制因子p53の変異が全てのケース6の〜百分の50から70までに関連した腫瘍における単一の最も頻繁に遺伝的損傷、です。 p53変異のかなりの部分が凝集体7の形成をもたらすp53のコンホメーションを変化させるミスセンス変異です。また、拡張したポリQストレッチを有するタンパク質は、遺伝的および病理学的にHDとSCAに関連付けられています。影響を受けたタンパク質におけるポリQストレッチの長さが一定THRESを超えるマニフェストこれらの進歩的な、しばしば致命的な疾患ホールド、およびポリQストレッチの長さが8を延長するよう、ますます深刻になります。 これらの疾患を治療するための魅力的なアプローチは、治療的にセルラPQCシステム、特に分解経路を強化することです。しかし、欠陥タンパク質の分解に関与する経路は、特に、哺乳動物細胞中で、十分に理解残ります。プロテアソームは、ミスフォールドタンパク質の分解のために非常に重要であることが認識されているが、重要な問題は、未定義のまま：特異的に認識し、分解の標的とされている方法をミスフォールドタンパク質。 PQCシステムは、細胞質、小胞体およびミトコンドリアなどの細胞区画において同定されているが、さらに、核内PQCシステムは2不明です。 私たちの研究室による最近の研究では、核内のミスフォールドタンパク質の多様性を認識し、分解するシステムを同定しました9哺乳動物細胞。このシステムは、前骨髄球性タンパク質（PML）、核タンパク質と三者モチーフ含有（TRIM）タンパク質ファミリーのメンバー、及びRNF4、タンパク質を含有するRINGドメインから構成されています。 PML、およびいくつかの他のTRIMタンパク質は、タンパク質のSUMO化10の特異性および効率を促進SUMO（小さ ​​なユビキチン様修飾因子）E3リガーゼ活性を有します。 RNF4は彼らにユビキチンリガーゼ活性11が得られるRINGドメインに加えて、1つまたは複数の大相撲相互作用モチーフ（SIMS）を含有するSUMO標的ユビキチンリガーゼ（STUbL）、の小さなグループに属しています。我々は、PMLは、具体的にミスフォールドタンパク質に明確な特徴を識別することができる個別の基質認識部位を介して、ミスフォールドタンパク質を認識することを発見しました。結合すると、PMLタグは内部SUMO化部位の存在に起因するポリ鎖を形成することができるSUMO2 / 3のポリ鎖、2ほぼ同一の哺乳動物のSUMOタンパク質を有するタンパク質をミスフォールド。 SUMOylatedミスフォールドタンパク質は、その後、それらのユビキチン化およびプロテアソーム分解につながるRNF4、によって認識されています。我々はさらにPMLの欠乏は、SCAタイプ1（SCA1）9のマウスモデルの行動と神経病理学的欠陥を悪化させるとしてPML-RNF4システムは、神経変性に対する保護のために重要であることを実証しました。 タンパク質レベルを調節することができる他の細胞機構からのタンパク質分解を区別するために、タンパク質の代謝回転率は9を測定しました。タンパク質の代謝回転を決定するために最も頻繁に使用される方法の中にパルス追跡およびシクロヘキシミド（CHX）チェイスです。これらの2つの方法は、それぞれ、時間をかけて翻訳熟練細胞および翻訳を阻害し、細胞中の目的の合計既存のタンパク質への関心の放射性同位体標識タンパク質を調べます。しかし、病原性とミスフォールディングが発生しやすいタンパク質を研究するための主要な課題は、これらのタンパク質の半減期は非常に見よすることができることですngの。例えば、アタキシン1、アタキシン7、ハンチンチン、αシヌクレイン、およびTDP-43のすべては、以上の12〜24時間9,12-16の半減期を有します。これらのタンパク質を保有する細胞は特にそれ自体が細胞に対して非常に毒性であり得るミスフォールドタンパク質ので、長時間の翻訳阻害に耐えられない可能性があるため、これらのタンパク質の遅い回転率は、CHXチェイス分析の使用を排除します。同位体標識と​​パルスチェイス分析も非常に凝集しやすいであるタンパク質のために挑戦することがあります。ほとんどのパルスチェイスアッセイはまた、放射性標識されているすべての他のタンパク質から目的のタンパク質を分離するために、免疫沈降に依存しています。この手順は、通常、不正確なSDS-PAGE電気泳動で解析を行う、SDS不溶性凝集体を形成することができる時に長い免疫沈降し、洗浄手順を含みます。 ここでは、低速回転率と核ミスフォールドタンパク質を分析するためのプロトコルが記載されている9。グルタミン82（Atxn1 82Q）のストレッチが含まれていアタキシン1（Atxn1）の病原型は、この目的の8のために使用されます。細胞内で発現された場合、核（ 図1A）でAtxn1 82Qの微視的形態可視介在物の増強された緑色蛍光タンパク質（GFP）融合。パルスチェイス分析はAtaxn1 82Qの半減期が18時間9以上であることが明らかになりました。 Atxn1 82Qは、ネイティブコンホメーションのミスフォールド特性の異なるコンフォメーションと同様に、種と種で構成されています。これらの種が異なる速度で分解される可能性があり、従って、別々に分析されるべきです。 Atxn1 82Q-GFP発現細胞からの溶解物は、NP-40水溶性（溶解性またはNS、おそらく天然のタンパク質またはミスフォールドオリゴマー/モノマータンパク質を表す）とNP-40不溶性（NI、集約/ミスフォールド）の部分に分画されます。 （;おそらく不規則凝集SS）又は（SDS耐性SR;後者は、さらにSDS可溶性に分割することができる可能性がアミロイド線維を）画分（ 図1B）。 SR画分をイムノ続くフィルター遅延アッセイにより検出することができるのに対し、NS及びSSフラクションを、ウェスタンブロットに続くSDS-PAGEによって分析することができます。 CHXチェイスは、界面活性剤分画法と組み合わせて、およびSS Atxn1 82Qの半減期は、SS画分が容易に認識し、分解され得ることを示し、NS Atxn1 82Qおよび総Atxn1 82Q（ 図2A）よりもはるかに短いことが発見されています細胞9インチしたがって、この方法は、ミスフォールドタンパク質のダイナミクスを研究するために、それらの分解パターンを比較するための強力なツールを提供します。 我々はまた、ミスフォールドタンパク質の分解を調節することができる巨大分子または小化合物を同定するためのハイスループットスクリーニングに適している方法を説明します。この方法は、ホタルルシフェラーゼ（LucDM）17、モデルシャペロン基板の立体構造的に不安定化変異体に基づいています。私たちは、ヒューズを持っています検出の便宜のためにdは、この細胞区画にPQCシステムをプローブする核局在化シグナル（NLS）にLucDM、およびGFP（NLS-LucDM-GFP）。細胞のわずかな割合でNLS-LucDM-GFPフォーム顕微鏡で見える核の凝集体（ 図3A）。 Atxn1 82Q、NLS-LucDM-GFP-ではなく、その野生型対応NLS-LucWT-GFP-さSUMO2 / 3によって修正されたとPML-RNF4経路9により規制と同様に。 SSおよびSR種の相対量は、プロトコル以下3に記載の条件を使用して、NSに比べてごくわずかですが、NLS-LucDM-GFPはまた、SSおよびSR種を形成しています。アッセイを簡素化するために、我々は唯一のSDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって（NSとSS画分の両方を含む）SDS可溶性LucDMを分析します。重要なことには、CHXチェイスアッセイは、SDS可溶性NLS-LucDM-GFPの半減期はLucDMを認識し、劣化システムに特異的な基質であることを示唆し、その野生型対応物（ 図3B）よりもはるかに短いことが示されましたミスフォールドタンパク質。 LucDM-GFPの分解は、全体的な蛍光シグナルの有意な低下を引き起こします。したがって、我々はまた、マイクロプレート蛍光ベースのアッセイを用いて細胞LucDM-GFPのリアルタイム検出のためのプロトコルを開発しました。多くのハイスループットスクリーニング（HTS）システムは、異常なタンパク質18-20によって引き起こされる細胞凝集体および細胞生存率を変更する薬剤や遺伝子のために開発されています。しかし、非常に少数のHTSsは、具体的には、哺乳動物細胞中での分解を標的とするために設計されています。このプロトコルは、細胞のミスフォールドタンパク質の分解のタンパク質の発現、ノックダウン、および薬物治療の効果の迅速かつ大規模な分析のために強固なシステムとして機能します。我々は、これら2つのミスフォールドタンパク質の分析のためのプロトコルを説明する以下の実施例として、HeLa細胞を用いました。トランスフェクション条件および時間経過は、個々の細胞株について最適化される必要があるかもしれないが、アッセイはまた、他の細胞株にも適用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11995-092</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">NP-40</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NP40S-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">SDS</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MG132</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45000232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:175px;">Roche Boehringer Mannheim</td>
			<td style="width:119px;">4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Bio-Dot Apparatus&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Living Colors GFP Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:175px;">Clonetech</td>
			<td style="width:119px;">632375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Anti-Actin mAb Rabbit, IgG</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A45060-200UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Amino acids</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Olympus IX-81&#160; Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:175px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX71/IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Greiner</td>
			<td style="width:119px;">89135-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200&#174; PRO</td>
			<td style="width:175px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;">Infinite 200&#174; PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Cellulose acetate membrane 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:175px;">Sterlitech</td>
			<td style="width:119px;">CA023001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Prism 5</td>
			<td style="width:175px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the degradation of misfolded proteins in cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

トランスフェクション後20時間（ 図1A）HeLa細胞の50％ -定常解析では、顕微鏡で可視Atxn1 82Q-GFPの核凝集体が30で観察することができます。抗GFP抗体を用いたNSとSS画分のウェスタンブロット分析は、タンパク質の分子量（ 図1B）に対応し、100キロダルトンと150 kDaのマーカー間Atxn1 82Q-GFPの別個のバンドを示します。 Atxn1 82Q-GFP SR画分中には、スタ...

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Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

細胞におけるミスフォールドタンパク質の分解のためのアッセイ

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.9K ビュー.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening. 

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Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

生物学

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Viability Assays for Cells in Culture

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized viability assays are expensive in terms of equipment but can be faster and more objective than manual cell counts. The present report describes the use of three such viability assays. Two of these assays are infrared and one is luminescent. Both infrared assays rely on a 16&#160;bit Odyssey Imager. One infrared assay uses the DRAQ5 stain for nuclei combined with the Sapphire stain for cytosol and is visualized in the 700 nm channel. The other infrared assay, an In-Cell Western, uses antibodies against cytoskeletal proteins (&#945;-tubulin or microtubule associated protein 2) and labels them in the 800 nm channel. The third viability assay is a commonly used luminescent assay for ATP, but we use a quarter of the recommended volume to save on cost. These measurements are all linear and correlate with the number of cells plated, but vary in sensitivity. All three assays circumvent time-consuming microscopy and sample the entire well, thereby reducing sampling error. Finally, all of the assays can easily be completed within one day of the end of the experiment, allowing greater numbers of experiments to be performed within short timeframes. However, they all rely on the assumption that cell numbers remain in proportion to signal strength after treatments, an assumption that is sometimes not met, especially for cellular ATP. Furthermore, if cells increase or decrease in size after treatment, this might affect signal strength without affecting cell number. We conclude that all viability assays, including manual counts, suffer from a number of caveats, but that computerized viability assays are well worth the initial investment. Using all three assays together yields a comprehensive view of cellular structure and function.

Therapeutic compounds are often first examined in vitro with viability assays. Blind cell counts by a human observer can be highly sensitive to small changes in cell number but do not assess function. Computerized viability assays, as described here, can assess both structure and function in an objective manner.

培養中の細胞のための生存率アッセイ

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

エア·液界面での人間の鼻上皮細胞の培養

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

セルベースの​​L-グルタチオン保護アッセイ細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスとリサイクルを研究するために、

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

β-カテニンの分解にの再構成<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵抽出

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the binding capabilities of GTPases for two reasons: The fact that all interactions involve the same face of the GTPases means that binding events must be considered in the context of competitors, and the fact that the bound nucleotide must also be controlled means that conventional approaches such as immunoprecipitation are unsuitable for GTPase biochemistry. The assay relies on the use of purified proteins. Purified Rac1 immobilized on beads is used as the bait protein, and can be loaded with GDP, a non-hydrolyzable version of GTP or left nucleotide free, so that the signaling stage to be investigated can be controlled. The binding proteins to be investigated are purified from mammalian cells, to allow correct folding, by means of a GFP tag. Use of the same tag on both proteins is important because not only does it allow rapid purification and elution, but also allows detection of both competitors with the same antibody during elution. This means that the relative amounts of the two bound proteins can be determined accurately.

This protocol compares the relative affinities of binding partners for Rho-family GTPases, including Rac1. In vivo, Rac1-binding proteins compete for a single binding interface, the conformation of which is dictated by a bound nucleotide. The nucleotide is both important and difficult to control experimentally, due to the high hydrolysis rate.

競合アッセイを使用してGTPアーゼ結合タンパク質の親和性を比較すると、

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...