私たちは、原稿上の彼らの助けとコメントのためにM. Bouchecareilh、E.Tétaud、S. Duvezin-Caubet、およびA.デヴィンへの感謝の意を表明します。私たちは、画像が撮影されたボルドーイメージングセンターの電子撮像ポールに感謝しています。この作品は、センター国立デラRECHERCHE科学研究によってサポートされていました。

ホルムバールグリッドフィルムの調製注：個人用保護具（手袋、白衣、メガネ）を使用して、ヒュームフードの下でクロロホルム操作を実行します。 400のメッシュの電子顕微鏡銅グリッドを使用してください。他のグリッドタイプ（他のメッシュサイズ、金とニッケルグリッド）で、凍結の品質が悪化しています。 <ol><li>クロロホルム中の0.3％ホルムバール100mLの溶液を調製します。それは、攪拌せずに一晩溶解させます。 </li><li>アセトンを含有するガラスバイアル（高さ3センチメートル及び径2a CM）中で400メッシュ（平方インチ当たりの穴の数）電子microscopycopperグリッド（直径3.05ミリメートル）を置きます。手の円運動でガラスバイアルをかき混ぜます。プラスチック製のトランスファーピペットを用いてアセトンを除去します。溶剤を5分間蒸発させます。濾紙上にそれらを注ぐことによって、グリッドを転送し、それらを5分間乾燥させます。 </li><li>滑り/光沢まで、糸くずの出ない布で拭いて76×26 mm 2のスライドガラスを研磨します。</li><li>晶析装置（直径15センチメートル、高さ：7 cmであり、容量1200 ml）に取り、蒸留水で縁にそれを埋めます。ほこりを取り除くために二回表面にガラス棒を渡して、水面を清掃してください。 </li><li>二本の指の間にガラススライドを持ち、数秒間ホルムバール溶液中に浸し。 5分間逆さまにビーカーの下で乾燥するために直立それを保持。 </li><li>膜が乾燥しているときに、スライドから除去されるフィルムの限界を定義するために鋭利なカミソリの刃を用いてガラススライドのエッジのスコア。 </li><li> 深呼吸をして、わずかに不透明なフィルムをレンダリングし、その視認性を高めるために、フィルムの上や下に水蒸気の層を得るために、スライド上に大きく息を吐きます。 <ol><li>直ちに約30°の角度でスライドの底に触れることにより、晶析装置の水面上に膜をフロート。スライドからフィルム剥離をしようと晶析装置の水面上にそれをはがします。ゆっくりとフィルムをやってのけますピンセット、必要に応じて。 </li></ol></li><li>穏やかグリッドは適切な厚さ（約10nm）および皺なしである領域に水面に浮かぶ膜上伏せ置きます。 </li><li> 彼らは晶析装置の水面に浮くようジョセフ・ペーパーでグリッドを覆うことによりフィルムをピックアップ。 <ol><li>片手でジョセフ紙を持ち、フィルムの一端にジョセフ紙の一方の端をタッチします。ジョセフ紙が完全に湿潤するまでお待ちください。引っかかってグリッドとジョセフの用紙を取り除きます。 </li></ol></li><li>室温で使用する前に最終的な乾燥および保管のために覆われたペトリ皿で24時間グリッドを置き。 </li></ol>凍結置換培地の調製注：四酸化オスミウム（のOsO 4）および酢酸ウラニルは、有害化学物質です。白衣や手袋など、適切な個人用保護具（PPE）を着用したままヒュームフードでそれらを扱います。 Foll（のOsO 4）を取り扱うための安全警告および酢酸ウラニルOW。 OsO 4の漏れを避けるために、Oリングの凍結バイアルを使用します。 <ol><li> 超微細構造の研究 <ol><li>ガラスフラスコにガラスのOsO 4アンプルを入れてください。 </li><li>フラスコを振ってアンプルを破ります。 </li><li> 4％の最終濃度を得るために、アセトン100％の適切なボリュームを追加します。 </li><li>攪拌し、1.8 mLのクリオバイアルに1.5 mLのアリコートを分配します。 </li></ol></li><li> タンパク質の免疫標識 <ol><li>ガラスフラスコに酢酸ウラニルを0.05gを置き。 </li><li> 100％のアセトン50mlを加えます。 </li><li>マグネチックスターラーで溶液を攪拌します。溶液が透明になったとき、0.2μmのフィルターを使用してフィルタリングします。 </li><li> 1.8 mLのクリオバイアルに1.5 mLのアリコートを分注します。 注：プランジ凍結プロセスの前に、凍結置換媒体を含むクライオバイアルを準備し、-84℃の冷凍庫に保管してください。捨ててガラスフラスコを反転有害廃棄物中のOsO 4アンプル。 </li></ol></li></ol>細胞の調製注：このステップは、方法の成功のために重要です。全ての細胞型のために、細胞の指示された数を得るために、細胞を増殖させます。指定された時間および速度で示される管内の遠心分離機。 <ol><li>次のように異なる細胞型からのペレットの適切な整合性を得るために、細胞を増殖させます。 <ol><li> サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びシゾサッカロミセス・ポンベのために、最小または完全液体培地5mlに酵母を接種します。 28℃、回転（180 rpm）で一晩インキュベートします。一晩培養物の600nmで（OD 600）での光学密度を測定します。 0.2ミリリットル50新鮮な選択培地のOD 600に酵母細胞を希釈します。 1×10 9酵母細胞7を得るために、回転し、28℃で細胞をインキュベートし続けます。 </li><li> リーシュマニア鞭毛のために、イノ7.5％FCS（ウシ胎児血清）とAM培地5mlでculate寄生虫。 24℃、回転（180 rpm）で一晩インキュベートします。一晩培養物のOD 600を測定します。 0.2ミリリットル50新鮮な選択培地のOD 600に寄生虫細胞を希釈します。 5×10 8寄生虫セル12を得るために、回転し、24℃で細胞をインキュベートし続けます。 </li><li> トリパノソーマのために、10％FCSおよび30μgの/ mLのハイグロマイシンを用いてSDM-79培地5mLに寄生虫を接種します。 27℃、回転（180 rpm）で一晩インキュベートします。一晩培養物のOD 600を測定します。 50mLの新鮮な選択培地中で0.2のOD 600に寄生虫細胞を希釈します。 5×10 8寄生虫細胞13を得るために、回転、27℃で細胞をインキュベートし続けます。 </li><li> 大腸菌のために、100μg/ mLのアンピシリンを有するDYT培地5ml中の細菌を接種します。 （180回転、37℃で一晩インキュベートしますRPM）。一晩培養物のOD 600を測定します。 0.2ミリリットル50新鮮な選択培地のOD 600に細菌細胞を希釈します。 5×10 10細菌細胞14を得るために、回転し、37℃で細胞をインキュベートし続けます。 注：一晩のインキュベーション後、培養中の細胞は、いずれかの対数または定常増殖期にあってもよいです。経験的に決定されるように非常にゆっくりと成長している細胞株は、一晩、または細胞のより多くの接種より長いインキュベーション時間を必要とするかもしれません。 </li></ol></li><li>全ての細胞タイプについて、1500×gで3分間、50 mlのポリプロピレン製チューブと遠心分離機に細胞を含む培地を移します。 </li><li>上清を除去し、関連する細胞培養培地1ml中の全ての細胞型のペレットを再懸濁します。 </li><li>遠心3,900×gで1分間マイクロ遠心チューブ内の全ての細胞型。完全に上清を除去します。 </li><li>氷の上で細胞を保管してください。 </li></ol>注意：注意して液体窒素を処理します。 cryoglovesやゴーグルなどの個人保護具を使用してください。プロパンは、潜在的に爆発性であるため、風通しのよい部屋またはヒュームフードの下で液化を行います。裸火禁止は許可されません。 <ol><li>ポリスチレントレイに液体窒素の約150ミリリットルを入れました。それを凍結し、液体窒素中で真鍮カップ（高さ3.6センチメートル、径2a cmであり、厚さ1.5ミリメートル）を置きます。液体窒素は、真鍮のカップの中に浸透させないでください。 </li><li>気泡が真鍮のカップが凍結されていることを確認するために治まるまで待ちます。 </li><li>真鍮カップ壁に接触してプロパンボンベに接続されたホースを入れてください。 </li><li>ゆっくりプロパンボンベのバルブを開きます。 注：このステップで、プロパンは真鍮カップで液化します。 </li><li>プロパンボンベのバルブを閉じて、急速にガスホースを除去することにより、液状化を停止します。 </li><li>液体NIポリスチレントレーを充填真鍮カップの上部から5mmまでトローゲン。液体窒素は、真鍮のカップの中に浸透させないでください。 </li></ol>サンプルの5プランジ凍結<ol><li>ポリスチレントレイに液体窒素の約200ミリリットルを入れました。液体窒素でそれらを置くことによって少し真鍮カップ（高さ直径1.5cm 2.5センチメートルと厚さ1ミリメートル）を凍結。 1つの懸濁細胞のサンプルに対して一杯に入れました。サンプルを混在しないように注意してください。このため、 などカップ2、で、カップ1のサンプル2をサンプル1を置きます。 </li><li>液体窒素中でその先端を沈めることにより、ピンセットをフリーズします。 </li><li> 3.5で得られたペレット中の針を解剖ダブルエッジプランジ。 </li><li>ピンセットを使用して、セクション1で調製したホルムバールでコーティングされた400メッシュ銅顕微鏡グリッドを取ります。 </li><li>解剖針を使用して、グリッド上3.5で得られたペレットのドロップを置きます。異なる液滴サイズ（ 例えば、2、5、10μL）を試してみてください。 </li><li>非常に急速に液体プロパン遺伝子の中にピンセットで開催されたグリッドを急落4章で評価し、数秒間円運動でグリッドをかき混ぜます。 </li><li>急速にセクション5.1で凍結した小さな真鍮カップにピンセットで凍結されたグリッドを転送します。 注：各試料について、少なくとも3つのグリッドを作ります。必ず、銅グリッドを取る前にピンセットを凍結します。 </li></ol> 6.凍結置換注：四酸化オスミウムが潜在的に揮発性であるので、蒸気カートリッジと空気浄化呼吸器を使用します。プランジ凍結も解決される前に液体窒素中で固定液を凍結。 <ol><li>超微細構造研究のために、セクション2.1で調製した凍結置換培地を含有する1.8mLのクライオバイアル管を開きます。免疫局在研究のために、セクション2.2で調製した凍結置換培地を含有する1.8mLのクライオバイアル管を開きます。クライオバイアルのキャップを置きます。 </li><li>液体窒素中でその先端を沈めることにより、ピンセットをフリーズします。 </li><li>急速にキャップを外し、冷凍グリッドiを転送しますピンセットを使用してクリオバイアルNTO。 </li><li>バッククライオバイアルのキャップを置きます。 </li><li>各サンプルの各グリッドのための操作を繰り返します。 </li><li>すべてのキャップを閉め、サンプルを凍結置換培地中であることを保証するために手の円運動とクリオバイアルをかき混ぜます。 </li><li>凍結置換処理中に-84℃の冷凍庫に3日間気密ボックス内の凍結バイアルを置きます。 </li></ol> 7.サンプル温暖化<ol><li> 微細研究 <ol><li> -30℃の冷凍庫に（急激な温度上昇を回避するため）、ポリスチレントレーで凍結バイアルを運びます。 1時間-30℃の冷凍庫でそれらを置きます。 </li><li> 2時間にわたって-15℃のフリーザーで凍結バイアルを置きます。 2時間4℃でサンプルを置き、次いで室温で30分間インキュベートしました。 </li><li>プラスチック製のトランスファーピペットで凍結置換媒体を取り外します。 100％アセトンの約500μLを追加します。 </li><li>クライオバイアル1.8ミリリットルをかき混ぜます急速に円形の手の動きとを有するガラスバイアルにグリッド（高さ3センチメートル及び直径2cmに）を含むアセトン（1.5ml）に注ぎます。 </li><li>すべてのグリッドを転送してください100％アセトン1mLで同じクライオバイアルをすすぎます。手の円運動とクライオバイアルを攪拌し、ガラスバイアル中にクリオバイアルの内容を注ぎます。 </li><li> 10分間、100％アセトン3mLの3回各ガラスバイアルをすすぎます。 </li><li>参照15で説明したように埋め込み、封入手順に従います。 （25％、50％、および75％）アセトン中のエポキシ樹脂の濃度を増加させてサンプルを含浸し、ゼラチンカプセル中の100％のエポキシ樹脂と試料を埋め込みます。 </li></ol></li><li> 免疫標識の研究 <ol><li>ポリスチレントレイに1.8 mLのクリオバイアルを運ぶ-30℃の冷凍庫に（急激な温度上昇を避けるため）。 </li><li> -30℃の冷凍庫に2時間クライオバイアルを置きます。 </li><li> -30°で<html> Cフリーザーに入れ、手の円形の動きでクライオバイアルを攪拌し、ポリプロピレンバイアル（高さ5cmおよび直径1.5cm）に凍結置換媒体を急速に注ぐ。 </li><li>凍結置換培地を2 mlの新しい凍結置換培地で置換する。 </li><li>ポリプロピレンバイアルを-30℃の冷凍庫に2時間入れます。 </li><li>ポリプロピレンバイアルを100mLの2mLのアセトンで1時間、100mLの2mLのエタノールで3時間3回洗浄します。 </li><li>参考文献15に記載されているように、埋め込みおよび包含手順に従ってください。サンプルをアクリル樹脂（25％、50％、および75％アセトン）の濃度を増加させて含浸させ、サンプルを100％アクリル樹脂でゼラチンカプセルに包埋する。 </li></ol></li></ol> 8.サンプルの可視化<ol><li>埋め込み後、サンプルの80nm超薄切片をウルトラミクロトームで作製する。セクションを2％クエン酸鉛と室温で1分間対照するお尻= &quot;外部参照&quot;&gt; 15。 </li><li>切片15を観察するために80キロボルト又は120 kVの電子顕微鏡を使用します。 </li></ol>

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著者は、彼らが興味の競合がないことを宣言します。

TEMは、細胞小器官、細胞、および組織の微細構造観察するための強力な方法です。低温固定/凍結置換は現在、超微細構造とタンパク質の抗原性の両方の保全のための最善の方法です。化学固定剤は、超微細2の完全な安定化の前に構造的再編成を許可することにより、非常にゆっくりと浸透し、行動します。逆に、低温固定/凍結置換は瞬時に細胞構造4を?...

サンプル調製は、電子顕微鏡検査の成功のために重要です。従来のEM固定は、透過型電子顕微鏡（TEM） 1の組織または細胞を固定するための主要な方法であった1 。まず、アルデヒドと四酸化オスミウムを用いて室温で材料を化学的に固定する。次いで、材料を有機溶媒で脱水し、浸透させ、エポキシ樹脂に包埋する。この方法は、細胞への固定剤の浸透率に依存する。結果として、アーチファクトおよび細胞内容物の抽出が通常観察される2 。 凍結融解は、明らかに、細胞構造3の保存のためのより良い選択肢であり、それらをそのまま維持する。薄い樹脂切片における最高品質のTEM画像4は、低温固定/凍結置換法を用いて得ることができる。この技術の目的は、ガラス化されたbiologicalサンプル氷晶形成せず、または細胞の超微細構造を損傷しない十分に小さな氷晶を含みます。 （HPF）を凍結高圧またプランジ凍結（PF）と呼ばれる超急速低温固定は、サンプルをcryofixするための2つの方法です。 HPFは瞬間セル内の分子を固定化し、従来のEM固定によって引き起こされる損傷を回避します。冷凍機や自動置換デバイスのいくつかのタイプが5を開発されています。冷凍機や消耗品（液体窒素等のキャリアを試料）は高価であり、それらは、高品質の電子顕微鏡写真6,7の製造を可能にします。 PFは、1950年代初期に使用された技術であり、PF手順を.During簡単で安価な8として文献に記載され、調製された試料は、氷の結晶が5nm未満3サイズ得るために急速に凍結されます。この目的を達成するために、サンプルがありますエタン、プロパン、エタンまたはプロパンの混合物として、液体寒剤に突入。 1950年代以来、PFの改善は、より多くのユーザーにこの技術を利用できるようにするために行われてきました。 PFは広く画像小さな物体（&lt;100 nmのに使用されるのに対し、高圧凍結は、現在、50ミクロン（ディスク状サンプルについて200μmの厚さまで）5よりも厚い試料の多種多様を凍結するための唯一の実行可能な方法であります）、アモルファス氷9の薄膜に懸濁高分子複合体など。より大きなサンプルは、例えば、真核細胞は、PFによってcryofixedすることができるが、そのようなキャピラリー銅管またはサンドイッチシステム8、10、11のように、試料ホルダーを必要とします。 ここでは、迅速で簡単に使用し、様々な懸濁細胞培養のために使用可能な低コストのプランジ凍結/凍結置換技術が提示されます。

<table><tbody><tr><td>Grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>Propane N35</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double edge dissecting needle</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72947</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19130</td><td></td></tr><tr><td>Glass vial 8.5 mL</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64252</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>48851</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>VWR international</td><td>631-9439</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrylic resin</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy resin M</td><td>Sigma</td><td>10951</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy resin M hardener</td><td>Sigma</td><td>10953</td><td></td></tr><tr><td>Dibutyl phtalate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy resin M accelerateur</td><td>Sigma</td><td>10952</td><td></td></tr><tr><td>Crystallizer</td><td>Fischer scientific</td><td>08-762-9</td><td></td></tr><tr><td>Joseph paper</td><td>VWR international</td><td>111-5009</td><td></td></tr><tr><td>Brass cups</td><td></td><td></td><td>do it yourself shop or made by yourself</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Saccharomyces cerevisiae&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shizosacharomyces cerevisiae&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trypanosoma brucei&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Leishmania amazonensis&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Airtight box</td><td>Fischer scientific</td><td>7135-0001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Air purifying respirator</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 7502&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge for respirator</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 6001</td><td></td></tr><tr><td>Particulate filter</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 5N11&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

plunge freezing: a tool for the ultrastructural and immunolocalization studies of suspension cells in transmission electron microscopy

透過型電子顕微鏡（TEM）は、タンパク質を局在化し、非常に高い分解能で高分子複合体を可視化するために、細胞の超微細構造を研究するための特別なツールです。しかし、本来の状態にできるだけ近い取得するには、完璧なサンプル保存が必要です。従来の電子顕微鏡（EM）アルデヒド固定、例えば、良好な超微細構造保存を提供しません。固定剤の遅い浸透は、様々な細胞成分の細胞の再編成および損失を誘発します。したがって、従来のEM固定は、構造および抗原性の瞬間的安定化および保存を可能にしません。細胞内事象を調べるための最良の選択は、その天然の状態で細胞を維持し、凍結置換固定法に続いて低温固定を使用することです。高圧凍結細胞の超微細構造の整合性を維持する/凍結置換は、最も一般的に使用される方法ですが、expensiが必要です機器VEの。ここでは、懸濁細胞培養のための凍結置換に続いて、使いやすく、低コストの凍結固定方法が提示されます。

この記事では、超微細構造（ 図1及び図2）及び免疫標識（ 図3）研究のために使いやすく、低コストのプランジ凍結方法が提供されます。私たちは、凍結置換法のためと温暖化手続きではなく、専用のシステムを使用して、24時間の6時間未満を取ることを特別な機器を用意する必要はありませんこと?...

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Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

この原稿は、透過型電子顕微鏡により懸濁細胞を可視化するために使いやすく、低コストの低温固定の方法を記載しています。

プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

plunge-freezing-tool-for-ultrastructural-immunolocalization-studies

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K ビュー.  Université de Bordeaux. この原稿は、透過型電子顕微鏡により懸濁細胞を可視化するために使いやすく、低コストの低温固定の方法を記載しています。 

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Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions and their disturbed homeostasis is involved in various diseases. State-of-the-art synchrotron X-ray fluorescence nanoprobes provide the required sensitivity and spatial resolution to elucidate the two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) distribution and concentration of metals inside entire cells at the organelle level. This opens new exciting scientific fields of investigation on the role of metals in the physiopathology of the cell. The cellular preparation is a key and often complex procedure, particularly for basic analysis. Although X-ray fluorescence techniques are now widespread and various preparation methods have been used, very few studies have investigated the preservation of the elemental content of cells at best, and no stepwise detailed protocol for the cryopreparation of adherent cells for X-ray fluorescence nanoprobes has been released so far. This is a description of a protocol that provides the stepwise cellular preparation for fast cryofixation to enable synchrotron X-ray fluorescence nano-analysis of cells in a frozen hydrated state when a cryogenic environment and transfer is available. In case nano-analysis has to be performed at room temperature, an additional procedure for freeze-drying the cryofixed adherent cellular preparation is provided. The proposed protocols have been successfully used in previous works, most recently in studying the 2D and 3D intracellular distribution of an organometallic compound in breast cancer cells.

Presented here is a protocol for cell culture on silicon nitride membranes and plunge-freezing prior to X-ray fluorescence imaging with a synchrotron cryogenic X-ray nanoprobe. When only room temperature nano-analysis is provided, the frozen samples can be further freeze-dried. These are critical steps to obtain information on the intracellular elemental composition.

窒化ケイ素膜上の細胞培養とシンクロトロンX線蛍光ナノ分析のための凍結製剤

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

生化学

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the structure of neurites is critical to understanding how these processes move materials and signals that support synaptic communication. Electron microscopy (EM) has been traditionally used to assess the ultrastructural features within neurites; however, the exposure to organic solvent during dehydration and resin embedding can distort structures. An important unmet goal is the formulation of procedures that allow for structural evaluations not impacted by such artifacts.
Here, we have established a detailed and reproducible protocol for growing and flash-freezing whole neurites of different primary neurons on electron microscopy grids followed by their examination with cryo-electron tomography (cryo-ET). This technique allows for 3-D visualization of frozen, hydrated neurites at nanometer resolution, facilitating assessment of their morphological differences. Our protocol yields an unprecedented view of dorsal root ganglion (DRG) neurites, and a visualization of hippocampal neurites in their near-native state. As such, these methods create a foundation for future studies on neurites of both normal neurons and those impacted by neurological disorders.

To preserve neuronal processes for ultrastructural analysis, we describe a protocol for plating of primary neurons on electron microscopy grids followed by flash freezing, yielding samples suspended in a layer of vitreous ice. These samples can be examined with a cryo-electron microscope to visualize structures at the nanometer scale.

低温電子断層撮影法を用いて凍結 - 和状態で神経突起を可視化するための一次ニューロンの調製

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

神経科学

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could easily be adapted for other biological samples. The basic principles for preparing samples, milling, and viewing lamellae are common to all instruments and the protocol can be followed as a general guide to on-grid cryo-lamella preparation for cryo-electron microscopy (cryoEM) and cryo-electron tomography (cryoET). Electron microscopy grids supporting the cells are plunge-frozen into liquid nitrogen-cooled liquid ethane using a manual or automated plunge freezer, then screened on a light microscope equipped with a cryo-stage. Frozen grids are transferred into a cryo-scanning electron microscope equipped with a focused ion beam (cryoFIB-SEM). Grids are routinely sputter coated prior to milling, which aids dispersal of charge build-up during milling. Alternatively, an e-beam rotary coater can be used to apply a layer of carbon-platinum to the grids, the exact thickness of which can be more precisely controlled. Once inside the cryoFIB-SEM an additional coating of an organoplatinum compound is applied to the surface of the grid via a gas injection system (GIS). This layer protects the front edge of the lamella as it is milled, the integrity of which is critical for achieving uniformly thin lamellae. Regions of interest are identified via SEM and milling is carried out in a step-wise fashion, reducing the current of the ion beam as the lamella reaches electron transparency, in order to avoid excessive heat generation. A grid with multiple lamellae is then transferred to a transmission electron microscope (TEM) under cryogenic conditions for tilt-series acquisition. A robust and contamination-free workflow for lamella preparation is an essential step for downstream techniques, including cellular cryoEM, cryoET, and sub-tomogram averaging. Development of these techniques, especially for lift-out and milling of high-pressure frozen samples, is of high-priority in the field.

Using focused ion beam milling to produce vitreous on-grid lamellae from plunge frozen biological samples for cryo-electron tomography.

クライオ電子線トモグラフィー用デュアルビーム走査電子顕微鏡を用いたガラス質生体試料からのラメラの調製(英語)

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires a thin layer of vitreous ice containing the biomolecules of interest. Despite numerous technological advances in recent years that have propelled single-particle cryoEM to the forefront of structural biology, the methods by which specimens are vitrified for high-resolution imaging often remain the rate-limiting step. Although numerous recent efforts have provided means to overcome hurdles frequently encountered during specimen vitrification, including the development of novel sample supports and innovative vitrification instrumentation, the traditional manually operated plunger remains a staple in the cryoEM community due to the low cost to purchase and ease of operation. Here, we provide detailed methods for using a standard, guillotine-style manually operated blot-and-plunge device for the vitrification of biological specimens for high-resolution imaging by single-particle cryoEM. Additionally, commonly encountered issues and troubleshooting recommendations for when a standard preparation fails to yield a suitable specimen are also described.

This manuscript outlines the blot-and-plunge method to manually freeze biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.

単粒子低温電子顕微鏡用生体試料の手動ブロットとプランジ凍結

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

細菌細胞の電子Cryotomography

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

生物学

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

生物学電子顕微鏡でのフリーズフラクチャー/フリーズエッチングの基本技術要素

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

タンデム高圧凍結および透過型電子顕微鏡のための植物組織の急速凍結置換

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.