細胞の絶妙な自然な超構造を観察するためには、急速凍結によって細胞を固定する必要があります。サンドイッチ凍結は、氷の結晶を形成せずに細胞を凍結するための最良の方法の一つです。このプロトコルは、サンドイッチ凍結装置の使用を実証し、またサンドイッチ凍結後の凍結置換標本の超薄いセクションを作るための手順を説明する。
サンドイッチ冷凍装置またはSFDの液体窒素容器を液体窒素で満たすことにより、液体プロパンの調製を開始します。微細なノズルを使用してプロパンガスを導入して、液体プロパン容器に液体プロパンを充填します。冷却された金属棒を使用してプロパンの凝固を加速します。
フラットタイプとバスケットタイプの銅ディスクを準備するには、文字なしの側を上にしてガラススライドに置き、10パスカル、400ボルト、30秒間1ミリアンペアでグロー放電で治療し、イオンスポッター装置を使用してディスク表面親水性にします。セル懸濁液を2ミリリットルの遠心管と遠心分離管に2、900回Gで室温で10秒間移す。上清を取り除き、ペレットを吊り下げ、厚い懸濁液を得る。
銅ディスクに少量または約0.02マイクロリットルのセル懸濁液を置きます。別の銅ディスクで覆い、ピンセットでディスクを拾います。薄い金属棒で固体プロパンの中央に井戸を作ります。
SFDにピンセットをセットし、装置の注入ボタンを押して急速に凍結します。使用したピンセットを室温の水に浸して、次の標本を凍結するために温めます。2.5%グルタルアルデヒド、0.1モルリン酸緩衝液pH 7.4に固定された動物およびヒト組織を使用してください。
ステレオ顕微鏡の下にカミソリの刃で0.1〜0.2ミリメートルの厚さのセクションにそれらをスライスします。バスケットタイプの銅ディスクにグルタルデヒド溶液の小さな滴を置き、ピンセットを使用して銅ディスクのグルタルアルデヒドに組織片を配置し、平らな銅ディスクで覆います。先に示したように、SFDの溶融プロパン中の組織でディスクを急速に凍結します。
作業浴中の液体窒素にディスクを移します。液体窒素で冷却されたピンセットのペアを使用して、試料を露出させるために互いからディスクを取り外します。液体窒素に入れ、固化した2%オスミウム四酸化スメウムを含むアセトンの1ミリリットルで満たされたガラスバイアルに細胞とディスクを入れます。
ディスクを深い冷凍庫に移し、細胞の凍結置換のために2〜4日間マイナス80度に保ちます。標本をマイナス20度で2時間、摂氏4度で2時間、室温で15分ずつインキュベートすることで、徐々に室温に導きます。ディスクを1ミリリットルのアセトンで満たされた2つのミリリットルプラスチックチューブに移します。
攪拌機を使用して使い捨てプラスチック容器に試薬を混合してエポキシ樹脂を調製します。アセトンを30%樹脂と相次いで交換し、室温で60%樹脂、90%樹脂を1時間交換し、90%樹脂を摂氏37度で100%樹脂と一晩交換します。最後に、シリコン埋め込み金型に100%樹脂にサンプルを埋め込み、60°Cで24時間重合します。
シリコン埋め込み金型から重合ブロックを取り出し、ブロックに検体番号を書き出します。カミソリの刃でブロックから銅ディスクを取り出し、ステレオ顕微鏡の下で超音波トリミングブレードとカミソリブレードを使用してブロック表面に埋め込まれた標本をトリミングします。次に、ミクロトームの試料ブロックチャックと検体ホルダーにテープを貼り、境界でテープを切断する。
超ミクロトームからブロックを取り出し、ステレオ顕微鏡にセットし、カミソリの刃を使用して0.3ミリメートルでさらに0.2ミリメートルにトリミングします。接着剤を作るためにグリッドにネオプレンを適用します。テープパーツを揃えて、超ミクロトームにブロックを戻します。
超マイクロトームをプラスチックカバーで覆い、厚さ50~70ナノメートルの部分をカットします。ループを使用してセクションを取得します。ネオプレンで処理された300または400メッシュ銅格線に取り付け、乾燥させます。
半分のシリコーン管の溝のセクションとグリッドを設定します。試料をウラニル酢酸溶液に3分間浸す。使用したウラニル溶液を収集し、シリンジに保存します。
水ジェットで半管で標本を洗い、その後、3分間クエン酸鉛に標本を浸します。酵母および真菌標本の場合は、フィルターペーパーの上にグリッドを置き、ピンセットで拾い、水面にプラズマポリマー化ナフタレンフィルムで覆います。電子顕微鏡の標本ホルダーにグリッドを挿入し、その後、標本ホルダーを電子顕微鏡に挿入し、100キロボルトで観察します。
電子顕微鏡下で観察した場合、大腸菌とS.cerevisiaeの両方の超薄い部分は、自然形態と明確な画像を示した。培養細胞の超薄い部分は、SFDを用いて急速に凍結し、電子顕微鏡下で観察した。人間の皮膚の超薄い部分の画像は非常に明確であり、自然形態を示した。
B型肝炎ウイルスコア粒子はSFDで急速に凍結し、クライオ電子顕微鏡で観察した。最も重要なことは、氷の結晶形成が凍結時に防止されるように、銅ディスクに非常に少量の細胞を適用する必要があるということです。動物組織をグルタルアルデヒドであらかじめ固定することにより、約200マイクロメートルの深さで良好な凍結が、高圧凍結によって達成される深さと同様に達成される。
この技術は、研究者が細胞の絶妙な自然な超構造を低コストで簡単に観察する道を開きます。
