私たちはTcdA1顕微鏡写真を提供してくれたD. Rodererに感謝します。 EMAN2インフラストラクチャの継続的なサポートに感謝します。この作業は、Max Planck Society（SR）と欧州連合（EU）の第七フレームワークプログラム（FP7 / 2007-2013）（付与番号615984）（SRへ）からの資金と、健康R01 GM60635からPAPへ）。

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	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. -. 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R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPARX,+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing.">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>de la Rosa-Trev&#236;n, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. 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著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

単粒子低温EMは、近年急速な発展を示し、主要な生物学的意義25の高分子複合体の多数の原子分解構造を送達した25 。現在フィールドに入っている多数の初心者ユーザをサポートするために、我々は単粒子画像解析プラットフォームSPHIREを開発し 、ムービーアライメント、パーティクルピッキング、CTF推定、初期モデル計算、2Dおよび3D異質性解析、高解像度3D精緻化および局所分解能推定およびフィルタリングを含む。 本明細書に記載されたプロトコールは、目的のタンパク質の低温EM顕微鏡写真を用いた3D構造決定、およびSPHIREの独立型GUIによって提供される計算ツールの助けを借りて、3D構造決定の短いガイドとして意図されている。 ワークフローの主な特徴は、再現性による検証の概念に依拠しており、パラメータ調整を必要としないため、手順のうちの1回だけを実行する必要があります。この自動検証メカニズムは、他のソフトウェアパッケージと比較してSPHIREの主な利点です。結果は客観的で再現性があり、最も重要なのは受け入れ可能な計算コストで得られる傾向があるからです。パイプラインは、経験豊富なユーザーが独自の方法でさらに独立した検証と評価を行うための豊富な診断情報を提供します。それにもかかわらず、構造生物学および電子顕微鏡法において少なくとも基本的な理論的背景を有する初心者ユーザは、それ自身のデータおよび自動化された検証手順を用いて原子に近い分解能構造を得ることができるはずである。 しかしながら、原子に近い分解能構造を得ることは、必ずしも直接的なものではなく、その結果は、サンプルの品質および入力データに大きく依存するa。ここに提示されている手順では、十分な数の高品質のアライメントされていない生のEMムービーが利用可能であり、それらの平均が明確に識別可能な均質で無作為に配向された単一粒子を示すと仮定する。一般に、分子の対称性、サイズまたは全体的な形状に関する制限はないが、特にタンパク質が特徴のない球状を有する場合、低分子量が制限因子であり得る。通常、高い点群対称性を有する、より大きく、規則正しい粒子の分析は、それほど厳しいものではありません。したがって、初心者ユーザは、まず特性の良い低温EMデータセットで本プロトコルを実行することを強くお勧めします。 SPHIREチュートリアルデータ（http：/sphire.mpg.de）またはEMPIARサブミットデータセット（https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/）のいずれかをRawムービーと一緒に使用することをお勧めします。 独自のデータを処理する場合、一部のデータセットまたは一部の画像が特定の品質を満たさない可能性が非常に高い基準。この文脈では、ワークフローの主要なステップのためにプログラムによって実行される自動化された安定性および再現性チェックに加えて、ユーザがプロトコルの特定の「チェックポイント」で結果を視覚的に検査することは依然として推奨されており、満足できるものではない。 最初の目視検査は、映画整列（ プロトコルステップ2 ）およびCTF推定（ プロトコルステップ3 ）後の顕微鏡写真レベルで行うことができる。得られたモーション補正された平均値は、はっきりと識別され、よく分離された単一粒子を示すはずであり、そのパワースペクトルははっきりと識別可能な等方性のトーンリングを示すべきである。それらが可視である空間周波数は、ほとんどの場合、構造が原則的に最終的に決定されることができる最高解像度を規定する。十分な品質とそのパワースペクトルの動き補正された平均の例は、セクション＃最終的な結果に悪影響を与える可能性のある異常画像は、SPHIREのDriftおよびCTFアセスメントGUIツール（http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php）の助けを借りて除去することができます。 パーティクルスクリーニングに関して、SPHIREパイプラインの重要なステップは、ISAC（ プロトコルステップ5.2）を使用した2D分類です。ここで、ユーザは、プログラムによって自動的に識別された再現可能な2Dクラス平均が、角度空間を準平準にカバーするのに十分な方向の範囲を採用するように制御すべきである。クラス平均の品質が満足できるものではない場合（ノイズの多い画像やぼやけた画像）、再現可能なクラス平均の数が非常に少ない場合は、自動ピッキング品質の改善、データセットのイメージングまたはサンプルの作成の最適化を検討してください。ほとんどの場合、良好な2Dクラス平均が得られないデータセットから信頼性の高い再構成を計算することはできません。高品質2Dクラスの例怒りは「代表的な結果」のセクションに示されています。 自動化された方法でRVIPERを使用して信頼性の高い初期3Dモデルを得るには、少なくとも100のクラス平均が必要です（ プロトコルステップ6.1 ）。このステップでは、ユーザは、最高品質の平均を選択し、可能な限り多くの異なる方向の粒子を含むべきである。初期モデルの品質は、その後の高解像度3D精緻化の成功のために重要である。 他のソフトウェアパッケージでは、「悪い」粒子8,9を除去するために3D分類が行われることがあります。しかし、SPHIREでは、ISACを使用して2次元分類を行う際に、これらの粒子のほとんどが自動的に削除されます。したがって、再構成および3D変動分析がデータセットの異質性を示す場合にのみ、3Dソーティングの計算集約的なステップを実行することが推奨されます。 最も重要なことは、ユーザーは常に、得られた3Dボリュームを注意深く注意深く検査し（ プロトコルステップ9.3 ）、それぞれの密度の特徴が公称解像度とよく一致することを確認する必要があります。 &lt;9Åの分解能では、α-ヘリックスに対応する棒状の密度が見えるようになる。 4.5Å未満の分解能では、βシート中の鎖に対応する密度は、通常、十分に分離され、かさばったアミノ酸が見えるようになる。高分解能マップ（&lt;3Å）では、明確な識別可能な側鎖が示され、正確な原子モデルの構築が可能になります。 今日までに得られた結果は、SPHIREの自動再現性試験および最小限の視覚検査の助けを借りて、現在のプロトコールが一般にあらゆるタイプの単一粒子クライオEMプロジェクトに適用可能であることを実証している。各処理工程の代表的な結果は、TcdA1毒素の再構築のために示されているPhotorhabdus luminescens 21であり 、これはほぼ原子分解能に解決されている。同様の品質の密度マップを使用して、デボリューションバックボーントレースと逆数または実空間のリファインメントによる信頼性の高い原子モデルを構築することができ、複雑な分子メカニズムを理解するための強固な構造フレームワークを提供します。 ACCESION CODES： EM構造および未処理の映画のための座標は、それぞれ、受託番号EMD-3645およびEMPIAR-10089で、電子顕微鏡データバンクおよび電子顕微鏡画像ファイルアーカイブに寄託されている。

直接電子検出器技術の開発後、単粒子低温EMの顕著な進歩は現在、構造生物学を改造している1 。 X線結晶学と比較して、この技術は結晶化を必要とせずに少量のタンパク質材料しか必要とせず、同時に試料の純度に関する制約が少なく、しかも原子分解能近くの構造の決定を可能にする。重要なことに、異なる組成物または状態をコンピュータで分離することができ、異なる立体配座の構造決定を前例のない詳細レベルで行うことができる。最近、デノボモデルの構築を可能にする解像度で、挑戦する分子の密度マップを生成することができ、従って、それらの作用様式の深い理解2,3,4,5。 3DEM（3D Electron Microscopy）コミュニティ（https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy）で幅広い種類の画像処理ソフトウェアパッケージが利用可能であり、そのほとんどは継続的に開発されています。 EMAN2 6 、IMAGIC 7 、FREALIGN 8 、RELION 9 、SPIDER 10 、およびSPARX 11を含むいくつかの異なるソフトウェアパッケージを用いて、様々な分子量および対称性を示すタンパク質について、ほぼ原子分解能が達成されている。各パッケージは、異なるレベルのユーザー専門知識を必要とし、異なるレベルのユーザーガイダンス、自動化および拡張性を提供します。さらに、いくつかのプログラムは、画像解析のすべてのステップを容易にするための完全な環境を提供する一方、他のプログラムは、既知のrから始まるアラインメントパラメータの改良など、特定のタスクを最適化するように設計されている推論構造。より最近では、APPION 12およびSCIPION 13を含むいくつかのプラットフォームが開発されており、上で列挙した様々なソフトウェアパッケージからのアプローチおよびプロトコルを統合する単一処理パイプラインを提供している。 低温EMの現在の発展に貢献するために、SPARXはSPHIRE（高分解能電子顕微鏡用SPARX）と呼ばれる単粒子分析のための新しいスタンドアロンで完全なプラットフォームに再開発されました。現場の新しい研究者のための技術のアクセシビリティを高め、現代の全自動ハイエンド電子顕微鏡によって生成された大量のデータに対処するために、処理パイプラインは使い易いグラフィカルユーザーインターフェイス（GUI）を使用して、ワークフローの主要なステップを自動化します。さらに、crからの迅速かつ再現可能かつ自動化された構造決定を可能にするための新しいアルゴリズムが追加されましたyo-EM画像。さらに、再現性による検証は、洗練および異質性分析中に生成される共通のアーチファクトを回避するために導入された。 このプログラムは大幅に変更されていますが、簡単なオープンソースコード、最新のオブジェクト指向設計、すべての基本機能のためのPythonインターフェイスなど、その重要な機能が維持されています。したがって、ブラックボックスプログラムに変更されていないため、ユーザーはPythonコードを学習して簡単に修正したり、追加のアプリケーションを作成したり、全体的なワークフローを変更したりすることができます。これは、非標準Cryo-EMプロジェクトに特に便利です。 ここでは、SPHIREのGUIを使用して低温EM画像から原子に近い解像度の密度マップを得るためのプロトコルを示します。生の低温EM直接検出器の映画から密度マップを生成するために必要とされるすべてのステップを詳細に記述しており、特定の巨大分子タイプに限定されるものではない。このプロトコルは、主にnewc現場でワークフローを説明し、処理の重要なステップと可能性のある落とし穴や障害に関する重要な情報を提供します。より高度な機能と、SPHIREの背後にある理論的背景については、他の箇所で説明します。

<table><tbody><tr><td>SPHIRE</td><td>Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund&amp;nbsp; and Houston Medical School, Houston, Texas&amp;nbsp;</td><td></td><td>http://sphire.mpg.de</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>University of California, San Francisco</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr><tr><td>Unblur</td><td>Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td><td></td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td></tr><tr><td>Coot</td><td>MRC Laboratory of Molecular Biology,&amp;nbsp; Cambridge</td><td></td><td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td></tr><tr><td>EMAN2</td><td>Baylor College of Medicine, Houston</td><td></td><td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td></tr><tr><td>Computing Cluster with 1824 cores</td><td>Max Planck Institute of Molecular Physiology</td><td></td><td>Linux Cluster with 76&amp;nbsp; nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM</td></tr><tr><td>TITAN KRIOS electron microscope&amp;nbsp;</td><td>FEI</td><td></td><td>300 kV, Cs correction, XFEG</td></tr><tr><td>Falcon II direct electron detector</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPU (automated data acquisition software)</td><td>FEI</td><td></td><td>https://www.fei.com/software/epu/</td></tr></tbody></table>

high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire

SPHIRE（高分解能電子顕微鏡用スパークス）は、単粒子電子冷凍顕微鏡（クライオEM）データの半自動処理のための、オープンソースで使いやすいソフトウェアスイートです。ここに提示されたプロトコルは、単一粒子構造決定パイプラインの全ステップを通してユーザを導くことにより、低温EM顕微鏡写真映画から始まる原子に近い解像度の構造を得る方法を詳細に説明している。これらの手順は、新しいSPHIREグラフィカルユーザーインターフェイスから制御され、ユーザーの操作を最小限に抑える必要があります。このプロトコールを使用して、Photorhabdus luminescensからのTc毒素複合体であるTcdA1の3.5Å構造は、9500個の単一粒子からのみ得られた。この合理化されたアプローチは、自然な状態で精製された巨大分子複合体のノイズのない、偏っていない原子モデルを得るために、広範な処理経験と先験的な構造情報なしで初心者ユーザを助けるでしょう。

<html>上記のプロトコルは、 Photorhabdus luminescens Tc複合体（TcdA1） 20,21,22の A成分の112個の直接検出器映画から開始して実行した。このデータセットは、300kVの加速電圧で動作する高輝度電界放出ガン（XFEG）を備えたCs補正電子凍結顕微鏡で記録した。画像は、標本スケールで1.14Åの画素サイズで60e - /Å -2の総線量で自動的に取得された。ムービーフレームのアライメント後（ プロトコルステップ2 ）、結果として得られたモーション補正された平均値は、等方性のトーンリングが高解像度に拡張されていました（ 図2a ）。個々の粒子は容易に目に見え、よく分離していた（ 図2b ）。次に、e2boxerの群ツールを使用してパーティクルを選んだlass = &quot;xref&quot;&gt; 18（ プロトコルステップ4.1 ）。この場合、より選択的なオプションを使用して適切な閾値を設定した（ 図2c ）。 112のデジタル顕微鏡写真は9,652個の粒子を生じた。抽出された画像の大部分（ プロトコルステップ4.2 ）は、明確に定義された粒子を含み、そのボックスサイズは、推奨されるように、粒子サイズの約1.5倍であった（ 図2d ）。次に、ISACを用いて、2D異種性分析を実施した（ プロトコールステップ5 ）。それは98のクラス平均をもたらした（ 図3a ）。これらの2Dクラス平均を用いて、中間分解能でVIPER（ プロトコルステップ6 ）を用いてab initioモデルを計算した（ 図3b ）。このモデルは、以前に3.9Åの分解能22で解決されたTcdA1の結晶構造との優れた一致を示す（ 図3c ）。このab initioモデルは、初期状態として使用された<html> （MERIDIEN）を用いて、約40,000個の非対称単位のみから3.5Å（0.143基準）再構成（ プロトコルステップ7 ）を得た（ 図4 ）。この原子に近い分解能のマップは、複数のコアの恩恵を受けるワークフローのステップで最大96個のCPUを使用して24時間以内に取得されました。 3次元変動分析（プロトコルステップ8）では、ステップ8.3.3でグループあたり2,000個の粒子画像のみが使用された（ すなわち 、プロセスは5個の初期3Dグループから開始する）。ステップ8.3.4で最小グループサイズ少数の粒子（〜10,000）。この分析は、主に、精製に使用されるHisタグを含む複合体のN末端領域で局所的な柔軟性を明らかにした（ 図5a ）。実際、TcdA1の以前に公開された結晶構造では、12個のN末端残基およびHisタグは分解されなかった受容体結合ドメインおよびBC結合​​ドメインでさらなる変動性が検出された（ 図5a ）。全体的にみて（ 図5a ）、この変動は、現在の低温EM密度において未解決のままであった。この構造の不均一性は許容可能であると判断され、したがって焦点を当てた3D分類23は行われなかった。最後に、最終濃度マップの局所分解能が計算された（ プロトコルステップ9.1、図この品質のボリュームは、Coot 24やその他のリファインメントツール（ 図6 ）を使用した新モデル構築に使用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;図1：SPHIREを使用した画像処理。 （ a ）SPHIREソフトウェアパッケージのGUI。ワークフローの特定のステップは、GUIの左側（「ワークフローステップ」）のそれぞれの絵文字を選択することによってアクティブにすることができます。ワークフローのこのステップに関連するコマンドとユーティリティは、GUIの中央領域に表示されます。コマンドの1つを選択すると、それぞれのパラメータがGUIの右側の領域に表示されます。高度なパラメータは通常、プリセットされたデフォルト値の変更を必要としません。 （ b ）SPHIRE GUIを用いた単一粒子画像処理のワークフローにおける段階。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> 図2：動きの補正と部分le抽出。 （ a 、 b ）1.7μmのデフォーカスで記録された典型的な高品質、低線量、ドリフト補正されたデジタル顕微鏡写真。パワースペクトル（a）において2.7オングストロームの分解能で伸びる等方性のトーンリングと、2D画像（ b ）における十分に識別可能な粒子に注目されたい。 （ c ）e2boxerを用いた粒子の選択。緑色の円は選択された粒子を示します。 （ d ）用量加重顕微鏡写真から抽出した典型的な生の粒子。スケールバー= 20nm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> 図3：2Dクラスタリングと初期モデル生成。 （ a ）2階級クラスの平均のギャラリー、多数の側面図を表すo<html>粒子。スケールバー= 20nm。 （ b ）参照フリークラスの平均からRVIPERを用​​いて得られたTcdA1のAb initio 3Dマップ。 （ c ）TcdA1結晶構造（リボン）（pdb-id 1VW1）の最初の低温EM密度（透明灰色）への剛体適合。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> 図4：TcdA1のクライオEM 3D構造。 （ a 、 b ）約9,500個の粒子画像を用いて計算されたTcdA1の最終3.5Å密度マップ：（ a ）側面および（ b ）上面図。 （ c ）αヘリックスおよびβシートの低温EM密度の代表的な領域。arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> 図5：変動分析とローカル解決。 （ a ）鋭利なTcdA1低温EMマップの表面（灰色）および可変性マップ（緑色）。より明確にするために、可変性マップを30Åまでローパスフィルタリングした。 （ b ）TcdA1鮮鋭化低温EMマップの表面レンダリングは、局所分解能（Å）に従って着色した。高いばらつきのある領域と低い局所分解能の間のトポロジカルな一致に注意してください。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> 図6：3DモードCootを用いたTcdA1の構築。低温EM密度および原子モデルの代表的な領域がα-ヘリックスについて示されている。原子モデルは、Cootを使用して新しく構築されました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

本稿では、ソフトウェアスイートSPHIREを使用して低温EM画像を処理するためのプロトコルを紹介します。現在のプロトコルは、ほぼ原子分解能を目標とするほぼすべての単一粒子EMプロジェクトに適用することができます。

SPHIREを用いた電子冷凍顕微鏡画像からの高分解能単一粒子解析

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

50.2K ビュー.  Max Planck Institute of Molecular Physiology. 本稿では、ソフトウェアスイートSPHIREを使用して低温EM画像を処理するためのプロトコルを紹介します。現在のプロトコルは、ほぼ原子分解能を目標とするほぼすべての単一粒子EMプロジェクトに適用することができます。 

ビデオ: High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

生化学

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and structure by spectrometry and scanning electron microscopy (SEM). A&#946;, which forms neurotoxic amyloid aggregates in Alzheimer&#39;s disease (AD), has been shown to interact with fibrinogen. This A&#946;-fibrinogen interaction makes the fibrin clot structurally abnormal and resistant to fibrinolysis. A&#946;-induced abnormalities in fibrin clotting may also contribute to cerebrovascular aspects of the AD pathology such as microinfarcts, inflammation, as well as, cerebral amyloid angiopathy (CAA). Given the potentially critical role of neurovascular deficits in AD pathology, developing compounds which can inhibit or lessen the A&#946;-fibrinogen interaction has promising therapeutic value. In vitro methods by which fibrin clot formation can be easily and systematically assessed are potentially useful tools for developing therapeutic compounds. Presented here is an optimized protocol for in vitro generation of the fibrin clot, as well as analysis of the effect of A&#946; and A&#946;-fibrinogen interaction inhibitors. The clot turbidity assay is rapid, highly reproducible and can be used to test multiple conditions simultaneously, allowing for the screening of large numbers of A&#946;-fibrinogen inhibitors. Hit compounds from this screening can be further evaluated for their ability to ameliorate A&#946;-induced structural abnormalities of the fibrin clot architecture using SEM. The effectiveness of these optimized protocols is demonstrated here using TDI-2760, a recently identified A&#946;-fibrinogen interaction inhibitor.

Presented here are two methods that can be used individually or in combination to analyze the effect of beta-amyloid on fibrin clot structure. Included is a protocol for creating an in vitro fibrin clot, followed by clot turbidity and scanning electron microscopy methods.

Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at near-atomic resolution. In single-particle analysis, the vitrified sample is imaged by an electron beam and the detectors at the end of the microscope column produce movies of that sample. These movies contain thousands of images of identical particles in random orientations. The data need to go through an image processing workflow with multiple steps to obtain the final 3D reconstructed volume. The goal of the image processing workflow is to identify the acquisition parameters to be able to reconstruct the specimen under study. Scipion provides all the tools to create this workflow using several image processing packages in an integrative framework, also allowing the traceability of the results. In this article the whole image processing workflow in Scipion is presented and discussed with data coming from a real test case, giving all the details necessary to go from the movies obtained by the microscope to a high resolution final 3D reconstruction. Also, the power of using consensus tools that allow combining methods, and confirming results along every step of the workflow, improving the accuracy of the obtained results, is discussed.

Single-particle analysis in cryo-electron microscopy is one of the main techniques used to determine the structure of biological ensembles at high resolution. Scipion provides the tools to create the whole pipeline to process the information acquired by the microscope and achieve a 3D reconstruction of the biological specimen.

クリオEMとシピオンによる単粒子分析

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The overall process involves i) vitrifying the specimen in a thin film supported on a cryoEM grid; ii) screening the specimen to assess particle distribution and ice quality; iii) if the grid is suitable, collecting a single particle dataset for analysis; and iv) image processing to yield an EM density map. In this protocol, an overview for each of these steps is provided, with a focus on the variables which a user can modify during the workflow and the troubleshooting of common issues. With remote microscope operation becoming standard in many facilities, variations on imaging protocols to assist users in efficient operation and imaging when physical access to the microscope is limited will be described.

Structure determination of macromolecular complexes using cryoEM has become routine for certain classes of proteins and complexes. Here, this pipeline is summarized (sample preparation, screening, data acquisition and processing) and readers are directed towards further detailed resources and variables that may be altered in the case of more challenging specimens.

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method for structural biologists to determine high-resolution structures of a wide variety of macromolecules. Multiple software suites are available to new and expert users for image processing and structure calculation, which streamline the same basic workflow: movies acquired by the microscope detectors undergo correction for beam-induced motion and contrast transfer function (CTF) estimation. Next, particle images are selected and extracted from averaged movie frames for iterative 2D and 3D classification, followed by 3D reconstruction, refinement, and validation. Because various software packages employ different algorithms and require varying levels of expertise to operate, the 3D maps they generate often differ in quality and resolution. Thus, users regularly transfer data between a variety of programs for optimal results. This paper provides a guide for users to navigate a workflow across the popular software packages: cryoSPARC v3, RELION-3, and Scipion 3 to obtain a near-atomic resolution structure of the adeno-associated virus (AAV). We first detail an image processing pipeline with cryoSPARC v3, as its efficient algorithms and easy-to-use GUI allow users to quickly arrive at a 3D map. In the next step, we use PyEM and in-house scripts to convert and transfer particle coordinates from the best quality 3D reconstruction obtained in cryoSPARC v3 to RELION-3 and Scipion 3 and recalculate 3D maps. Finally, we outline steps for further refinement and validation of the resultant structures by integrating algorithms from RELION-3 and Scipion 3. In this article, we describe how to effectively utilize three processing platforms to create a single and robust workflow applicable to a variety of data sets for high-resolution structure determination.

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

This article describes how to effectively utilize three cryo-EM processing platforms, i.e., cryoSPARC v3, RELION-3, and Scipion 3, to create a single and robust workflow applicable to a variety of single-particle data sets for high-resolution structure determination.

クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

クライオ電子顕微鏡グリッドを単層グラフェンでコーティングし、クライオサンプル調製を改善

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to remove excess liquid and rapidly frozen in a roughly 20-100 nm thick layer of vitreous ice, suspended across roughly 1 &#181;m wide foil holes. The resulting sample is imaged using cryogenic transmission electron microscopy, and after image processing using suitable software, near-atomic resolution structures can be determined. Despite cryoEM&#39;s widespread adoption, sample preparation remains a severe bottleneck in cryoEM workflows, with users often encountering challenges related to samples behaving poorly in the suspended vitreous ice. Recently, methods have been developed to modify cryoEM grids with a single continuous layer of graphene, which acts as a support surface that often increases particle density in the imaged area and can reduce interactions between particles and the air-water interface. Here, we provide detailed protocols for the application of graphene to cryoEM grids and for rapidly assessing the relative hydrophilicity of the resulting grids. Additionally, we describe an EM-based method to confirm the presence of graphene by visualizing its characteristic diffraction pattern. Finally, we demonstrate the utility of these graphene supports by rapidly reconstructing a 2.7 &#197; resolution density map of a Cas9 complex using a pure sample at a relatively low concentration.

著者スポットライト:顕微鏡グリッド上のグラフェン単層を使用したクライオ電子顕微鏡サンプル調製の強化 

The application of support layers to cryogenic electron microscopy (cryoEM) grids can increase particle density, limit interactions with the air-water interface, reduce beam-induced motion, and improve the distribution of particle orientations. This paper describes a robust protocol for coating cryoEM grids with a monolayer of graphene for improved cryo-sample preparation.

単層グラフェンのクライオ電子顕微鏡グリッドへの高分解能構造決定への応用

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for the high-resolution structure determination of biological macromolecules. Despite the remarkable advances in cryo-EM, there is still scope for improvement in various aspects of the single-particle analysis workflow. Single-particle analysis demands a suitable software package for high-throughput automatic data acquisition. Several automatic data acquisition software packages were developed for automatic imaging for single-particle cryo-EM in the last eight years. This paper presents an application of a fully automated image acquisition pipeline for vitrified biomolecules under low-dose conditions. 
It demonstrates a software package, which can collect cryo-EM data fully, automatically, and precisely. Additionally, various microscopic parameters are easily controlled by this software package. This protocol demonstrates the potential of this software package in automated imaging of the severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike protein with a 200 keV cryo-electron microscope equipped with a direct electron detector (DED). Around 3,000 cryo-EM movie images were acquired in a single session (48 h) of data collection, yielding an atomic-resolution structure of the spike protein of SARS-CoV-2. Furthermore, this structural study indicates that the spike protein adopts two major conformations, 1-RBD (receptor-binding domain) up open and all RBD down closed conformations.

Single-particle cryo-electron microscopy demands a suitable software package and user-friendly pipeline for high-throughput automatic data acquisition. Here, we present the application of a fully automated image acquisition software package, Latitude-S, and a practical pipeline for data collection of vitrified biomolecules under low-dose conditions.

単粒子クライオ電子顕微鏡用のユーザーフレンドリー、ハイスループット、および完全自動データ収集ソフトウェア

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for ...

SPHIREを用いた電子冷凍顕微鏡画像からの高分解能単一粒子解析

要約

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結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオンチャネル TRPC3 の精製

クリオEMとシピオンによる単粒子分析

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

単層グラフェンのクライオ電子顕微鏡グリッドへの高分解能構造決定への応用

単層グラフェンのクライオ電子顕微鏡グリッドへの高分解能構造決定への応用

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SPHIREを用いた電子冷凍顕微鏡画像からの高分解能単一粒子解析

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クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

単層グラフェンのクライオ電子顕微鏡グリッドへの高分解能構造決定への応用

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単粒子クライオ電子顕微鏡用のユーザーフレンドリー、ハイスループット、および完全自動データ収集ソフトウェア

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオンチャネル TRPC3 の精製