乗組員、EM操作、消化管インハブ状態A M P AによるS1PRSの活性化と薬物再計算の気分と、S1PRSをしっかりと標的とする薬剤を開発するためのそれほど重要ではない基盤に取り組みました。 進歩により、GP ZR刺激または居住の壮大な下絵を可視化することが可能になり、T BCR標的薬物作成の正常な結合部位を明らかにする上でさらに利益が得られます。サンプルの品質は、正しいEM実験のすべての基盤です。簡単な準備に不可欠な要素には、SFライン販売のさまざまな製品状態とNg濃度が含まれます 手順のデモンストレーションは、私のレベルの大学院生であるHeli Wangになります。
タンパク質精製のために、このフィンガーシーン一リン酸受容体またはS一P R SGタンパク質複合体溶液をサイズ排除クロマトグラフィーまたはSECゲル濾過カラムに負荷し、摂氏4度で毎分0.5ミリリットルの流速でSEC緩衝液で予め平衡化した。収集した画分をクライオ電子顕微鏡に使用するには、摂氏4度で1, 300 XGの100キロダルトンカットオフ濃縮器を使用してそれらを濃縮します。粒子の予備分類での2D分類のデータ処理中に、Rely Onソフトウェアで2D分類機能を選択し、[IO]オプションで入力画像のスターファイルの右側にある[参照]をクリックします。
次に、パーティクルスターを選択します。次に、最適化オプションで、クラス数を100に設定し、マスク直径Aを140に設定します。コンピューティング オプションで、プールされたパーティクルの数を 10 に設定し、高速のローカル ドライブから [パーティクルをスクラッチ ディレクトリにコピー] フィールドにディレクトリを入力します。
処理を高速化するには、使用するGPUアクセラレーションに対して[はい]を選択します。良好な2D結果をテンプレートとしてサブセット選択するには、サブセット選択関数のIOオプションに移動し、model.starから選択したクラスの右側にある参照をクリックします。次に、[run_it025_model] を選択します。
入力としてスターを付け、ポップアップウィンドウで[実行]をクリックして、[画像の並べ替え]と[逆並べ替え]をオンにします。次に、ディスプレイをクリックします。自動ピッキング機能の参照の参照として適切な代表的な2D結果を選択した後、右クリックして選択したクラスを保存を選択します。
自動ピッキングの2回目のラウンドにテンプレートを使用するには、自動ピッキング機能のIOオプションに移動します。自動ピックの入力顕微鏡写真の右側にある参照をクリックし、micrographs.starを選択します。次に、2D参照の右側にある[参照]をクリックし、[class_averages.star]を選択します。
また、ガウス分布の no を選択するか、レプロシアンを使用します。次に、コードアンダースコアサフィックスアンダースコアautopick.starを使用してパーティクル抽出を実行します。パーティクルを使用して 2D 分類を実行します。
スター、続いて実行アンダースコアを使用してサブセットを選択し、ゼロ20 five_optimizerします。星 粒子抽出の場合は、[IO]オプションで顕微鏡写真の星形のファイルの右側にある[参照]をクリックした後、[顕微鏡写真]を選択します。スターを付けて、[はい]を選択するか、精製されたパーティクルを再抽出します。
[リファインされたパーティクル]スター ファイルの右側にある[参照]をクリックした後、[パーティクル]を選択します。星初期3Dモデルと参照マップを生成するには、IOオプションで入力画像の星ファイルの右側にある3D初期モデルの参照をクリックし、前のparticles.starを選択します。次に、最適化オプションで、クラスの数を1に設定し、マスクの直径Aを140に設定します。
3D分類と予備的な3Dマップの生成のために、粒子を選択した後。スター 前に示したように、参照マップの右側にある [参照] をクリックし、[初期アンダースコア モデル ドット MRC] を選択します。次に、最適化オプションで、クラスの数を4〜6に設定し、マスク直径Aを140に設定します。
マスク生成では、IOオプションで入力として適切な3Dマップを選択した後、初期二値化しきい値を0.05に設定し、このピクセル数への拡張バイナリマップを3に設定します。次に、マスクオプションに移動して設定します。この多くのピクセルにソフトエッジを8に追加します。
次の処理では、Trino Sparkソフトウェアを開き、新しいワークスペースを作成して、最初のジョブのジョブビルダーをクリックします。パーティクルスタックを読み込むには、「パーティクル」メタパスフィールドにパーティクルパスを入力し、「パーティクルデータパス」フィールドにムービーパスを入力します。次に、以前に生成された最適な 3D ボリュームのパスをボリュームデータパスに入力し、インポートするボリュームの種類のマスクを選択して、3D ボリュームをインポートします。
不均一な細分化を行うには、以前に生成されたインポートされたアンダースコア パーティクルを、不均一な細分化パーティクルの入力としてドラッグします。インポートされたアンダースコアボリューム、不均一な細分化ボリュームの入力としてアンダースコア1、およびインポートされたアンダースコアマスクは、不均一な細分化マスクの入力として1を下線します。マスク。次に、Qをクリックして処理を開始し、手順を繰り返して良好な解像度を取得します。
S1PRGI 3Dマップ。プラスミドを構築し、一過性トランスフェクションの準備をした後、調製したDNAを200マイクロリットルのトランスフェクション試薬バッファーに加えます。使用前に10秒間ボルテックスし、混合物を短時間回転させて混合します。
4マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加え、前述のようにボルテックスとスピニングによって混合します。チューブを室温で15分間インキュベートした後、CHOK 1細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルに200マイクロリットルのトランスフェクションミックスをゆっくりと滴下し、プレートを静かに振るか、完全に混合します。4〜6時間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターに戻す前に、トランスフェクション培地をF 12培地と10%fbsからなる細胞増殖培地と交換します。
細胞の切断採取後24〜48時間に、Dルシフェリアンカリウム塩を含む3ミリリットルのSA緩衝液中に細胞を懸濁する。次いで、マルチチャンネルピペットを用いて、穏やかに混合した96ウェルプレートの各ウェルに90マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、室温で40分間インキュベートする。蛍光シグナル測定のために、まず、DMS O中のシポニモドの10ミリモルストック溶液を調製し、次に25マイクロモルのフォルスカリンを含むH B S Sバッファーで段階希釈を行い、このアゴニスト溶液の10マイクロリットルの様々な濃度で細胞を30分間刺激します。
次に、検出方法のために発光を選択してマイクロプレートリーダーで発光信号をカウントする。読み取りタイプのエンドポイント、および関連付けられたソフトウェアの光学タイプの発光ファイバー。また、光学ゲインを255に設定します。
次に、得られた蛍光シグナル値をスプレッドシートプログラムにインポートし、非線形回帰曲線フィット線量反応関数を使用してデータを処理します。S1PRS GI複合体は、SDSページで検証されたサイズ排除クロマトグラフィーによって正常に精製できました。さらに、この研究で従った電子顕微鏡プロトコルは、明確で明確に定義された2Dクラスを持つS1PRSGI粒子と低品質の粒子を区別するのに効果的でした。
さらに、S1PR3 GIの電子顕微鏡マップは、不均一な微細化によるフリアーシェル相関によって良好な分解能で生成できる可能性があります。構造解析後、受容体とセンサープラスミドを用いたC H O K 1細胞のトランスフェクションにより、S one P R 3の機能アッセイを行い、受容体プラスミドとセンサープラスミドの比率が1対3で最適な結果が得られることが明らかになりました。しかし、結果は、その処理において、粒子セクションおよび2Dおよび3D分類のセクションでのアルゴリズムの選択は、特にリークおよびECFをモデル化するためにMPS Gタンパク質複合体を解決するために重要である。
