右平均二乗変位法イメージング法は、生きたサンプル中の標的生体物体の構造と動的平均特性の両方を同時に抽出することができます。右平均二乗変位のイメージングは、高速で堅牢な手順であり、単一のオブジェクト軌道を抽出する必要はなく、複雑なラベリングも必要ありません。必要なのは、標準的な光学セットアップと蛍光ラベルの付いた対象オブジェクトだけです。
この方法は、癌、糖尿病、または神経変性障害などのいくつかの病理学的状態において細胞内ナノ構造のレベルで見出される構造的および動的変化の大規模かつ定量的スクリーニングへの道を開く。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるFabio Azzarelloです。細胞の継代培養を開始するには、コンフルエントなヘラ細胞の10センチメートル組織培養処理皿を、0.01モルPBSで2回洗浄することから始める。
次に、1ミリリットルの0.05%トリプシン-EDTAを加え、ディッシュを摂氏37度および二酸化炭素5%で5分間インキュベートする。剥離した細胞を9ミリリットルの完全DMEM培地に再懸濁し、トリプシンを含む全培地10ミリリットルを遠沈管に集める。約20万個の細胞を各35ミリメートル×10ミリメートルの皿に、1ミリリットルの最終培地容量で播種し、次いで細胞をインキュベートする。
目的の細胞内構造に応じて、特定の標識方法が必要であり、標識溶液の準備ができたら、0.01モルPBSで細胞を2回洗浄する。PBSを色素試薬含有培地で置き換えた後、メーカーの推奨に従って、ディッシュを摂氏37度および二酸化炭素5%でインキュベートする。インキュベーションの最後に、実験前に細胞を新鮮な培地で2回洗浄する。
タイムラプスシリーズ取得を実行する前に、顕微鏡インキュベーター制御システムをオンにし、顕微鏡を摂氏37度と二酸化炭素5%で約2時間平衡化させます。トランスフェクトされた細胞におけるEGFPの励起に488ナノメートルのアルゴンレーザーを使用し、蛍光標識されたマクロピネソームを使用し、標準的な光電子増倍管検出器を使用して、500〜600ナノメートルの蛍光発光を収集します。543ナノメートルのヘリウムネオンレーザーを使用して蛍光色素を励起し、555〜655ナノメートルの発光を収集します。
検出ピンホールの直径を 1 つの Eri のサイズに設定します。そして、各取得ごとに、一連の1000シーケンシャルフレームを収集します。ピクセルの滞留時間をピクセルあたり 2 マイクロ秒に設定し、フレーム時間は 129 ミリ秒にします。
集録の器械パラメータを正しく初期化するには、iMSDを開きます。M とソフトウェアのテキストエディタを使用します。パラメーターを設定するには、時系列のフレーム数として N'、マイクロメートル単位のピクセル サイズ、および秒単位の時間分解能として f'の値を入力します。
さらに、入力されたフィルタ背景補正をゼロに設定し、生画像を処理するか、または1つを設定して、閾値ベースの背景減算を実行する。次に、バックグラウンド補正のAV料金しきい値を設定します。フィルター値を 1 に設定すると、しきい値より低い強度のピクセルはゼロに設定されます。
次に、強度サンプリングを決定する整数としてビットを設定する。編集した iMSD を保存して実行します。M スクリプト ファイル。
コマンドウィンドウでスクリプトの実行を確認し、問題が発生した場合は中断された警告メッセージが表示されます。スクリプトの実行が成功したら、必要に応じてイメージスタックをインポートし、背景を減算します。次に、フーリエ法を用いて空間時間相関関数を計算する。
時空間相関関数を 2D ガウス関数に当てはめます。次に、IMSD 曲線と対応するフィッティングカーブを使用してグラフィカル出力を確認し、使用するフィッティング方程式の異なるタイプについて 3 つの別々のパネルに表示されます。R二乗値はグラフの凡例に示されています。
次に、テキスト出力を確認します。被検細胞小器官としてのリソソームの画像取得を、生細胞において適切な時間分解能で行い、かつ極めて低い時間分解能とした。オルガネラ運動によるリソソームのアーチファクト変形を、低解像度画像で可視化した。
スポットの強度プロファイルは、画像解析ソフトウェアのラインツールを使用して導出した。そして、ガウス関数により強度をプロット・補間することによりスポット径推定を行った。高速での取得により、固定サンプルに近い同等の平均構造サイズが得られた。
代わりに、低速での取得は、画像化中の自然な構造ダイナミクスのために、構造サイズを増加させた。マクロピネソームの構造的および動的特性は、トラフィッキング中に観察された。観察結果は、マクロピノソームの平均サイズの減少を明らかにした。
副拡散運動の付随的な増加を、減少したα'値によって表した。各取得について、経時的なマクロピネソーム数の増加は、観察されなかった。対照的に、ISGについて行われた同様の測定は、マクロピネソームと比較してこれらの後者の細胞小器官の非常に異なる挙動を示唆した。
実際、インスリン顆粒は、不変、平均構造的、または動的特性を示し、それらが静止状態でプローブされたことを示唆している。この方法は、2つの異なる細胞内小器官が異なる方法で標識されている場合、デュアルカラーモードで容易に適用することができる。この場合、相互相関分析は、セル内の 2 つのオブジェクトの潜在的な動的相互作用を強調します。
