Name: afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell
Uploaded: 2017-11-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

Biz Amayra Hernández-Vega ve Philippe-Alexandre Pouille bu protokoller için temel ayarlamak için katıldığınız için teşekkür ederiz. Ayrıca moleküler görüntüleme platformu IBMB-PCB, Xavier Esteban ve üyeleri, laboratuvar sürekli destek için teşekkür ederiz. Generalitat de Catalunya ve DGI ve Ekonomi Bakanlığı ve günümüzde İspanya'dan gelen Consolider hibe EMB ve DN konsolide grupları programı bu çalışmaları destekledi.

Aşağıda açıklanan tüm iletişim kuralı adımları kurumlarımıza hayvan bakımı yönergeleri izleyin.
1. Zebra balığı kültür
<ol><li>Doğurmak ve standart koşullar altında yetişkin Zebra balığı korumak. Not: Bu çalışma için AB ve TL vahşi türü embriyo kullanılmıştır.</li>
	<li>Embriyo toplamak ve onları E3 embriyo orta24' te 28.5 ° C'de büyümek. Onları Morfoloji göre yukarıda açıklanan19sahne.</li>
</ol>2. Atomik kuvvet mikroskobu
<ol><li>El ile dechorionate Zebra balığı embriyo (bireysel ilgi alanlarına göre farklı yaştan) düzenledi. Chorions iki ince ve keskin forseps ( Tablo malzemelerigörmek) kaldırın.<ol>
<li>Bir forseps kullanarak koryon kavrama ve gözyaşı içinde diğer Forseps ile yapmak. Daha sonra bu gözyaşı ters bir bölgede koryon holding, embriyo delikten hafifçe itin.</li>
		<li>Dechorionation büyütme 8 X ve 50 X arasında ayarlanabilir bir dizi ile bir diseksiyon stereomicroscope altında gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Embriyo AFM için mount
	<ol>
<li>Embriyo orta % 2 özel bir çözüm hazırlamak ve 35 mm Petri kabına bu ile doldurun. Kuvvetlendirmek izin. Özel yatakta ince Forseps ile 1.5 mm çapında (iki embriyo katı) ve yaklaşık 350 µm derinlik (yarım embriyo boyutu) küçük delikler yapmak.</li>
		<li>Özel katmanda yapılan sokmak embriyoların yer ve onlar özel embriyo orta yerde etrafında % 0,5 düşük bir çözüm yayarak erime vardır sizi temin ederim. Sadece onları deliklere güvenli embriyo etrafında bu çözüm dökün.</li>
		<li>Düşük erime noktası özel oda sıcaklığında katılaşır önce embriyo tarafından AFM probed ilgi bölge yukarı doğru (şekil 1A) karşıya gelecek şekilde döndürün.</li>
	</ol></li>
	<li>AFM tarafından embriyo incelemek
	<ol>
<li>Bulun ve bir 20 X objektif bir ters Atomik kuvvet mikroskobu istihdam petri kabına embriyo resim (bkz. Tablo reçetesi25) oda sıcaklığında (23-24 ° C). Not: Embriyo embriyo ortamda dalmış ve özel yatağa bağlı canlı tutulur.</li>
		<li>Döküm embriyo bir konsol bir nominal bahar sabit 5 mikron ve 1 Hz için onun sık sık oluş olarak konsol salınım en yüksek zirve genliğini N/m. ayarlayın 0.01 ile bağlı çapı 4.5 µm küresel polistren boncuk istihdam sarısı hücre yüzeyine sonda.</li>
		<li>Farklı pozisyonlar ve birkaç embriyolar ortalama veri için bir rutin olarak test edilecek her bölge için veri toplamak. Not: Beş pozisyonlar AFM mikroskop XY piezo-erişim düzenekleri ile prensibine göre konumunu kontrol ederek orta ve 10 µm x 10 µm kare köşelerinde bulunan soruşturma için iyi bir başlangıç noktası olduğunu. Görüntüleme ve veri toplama embriyo başına yaklaşık 20 dakika sürdü. Veri embriyo sarısı hücre yüzeyine farklı bölgelerinde kayıt, örneğin, bitkisel kutup veya farklı bölgeleri EVL hücre kenar boşluğu (şekil 1B ve 1 C), yakın sadece yapılabilir ayrı numuneler farklı yönelik istihdam ederek.</li>
	</ol></li>
	<li>Kuvvetleri hesaplamak
	<ol>
<li>Piezo-aktüatörler ve çeyreği fotodiyot kullanma onun saptırma (d) optik kolu yöntemle mikroskop kontrol yazılımı ile birleştiğinde ağırlık ölçme esneklik detektörler sensörleri ile AFM konsol (z) dikey yerinden ölçmek ( Tablo malzemeleri görmek 25).</li>
		<li>Bir cam coverslip çıplak bir bölgeden toplanan verilerden elde edilen bir d-z eğrinin eğim fotodiyot sinyal ve konsol saptırma (d) arasındaki ilişkiyi ayarlamak için kullanın. Not: Konsol saptırma ölçülen dikey deplasman eşittir ve yamaç optik kolu26saptırma duyarlılığını temsil eder.</li>
		<li>Termal dalgalanmaları gelen konsol bahar sabiti (k) daha önce27açıklandığı gibi algılayın.</li>
		<li>Örnek (h) girinti olarak hesaplamak: h (z - zc) = -(d - dkapalı)          (1) Not: Burada zc temas noktası konumunu ve dkapalı fotodiyot uzaklık.</li>
		<li>Kuvvet (F) konsol Hesapla: F = k · d (2)</li>
	</ol></li>
	<li>Viskoz sıvı kapsayan kortikal gerginlik Tc elastik bir tabakanın oluşan bir sıvı-balon modeli açısından korteksin gerginlik hesaplayın. Bu modelde, (göre embriyo boyutu), küçük girintili yazımları için kuvvet orantılı olarak4,28 olarak artar: F 4π Tc= [(Rb / Re) + 1)] h (3) Not: Burada Rb boncuk yarıçapı ve Re embriyo yarıçapı. Embriyo (400 µm) RADIUS iki büyüklük boncuk (2,25 µm), daha büyük olduğu gibi Zebra balığı embriyo için olarak bu denklem yaklaşık: F = 4π Tc h (4)<ol>
<li>Gerilim kuvveti-girinti (F-h) hesaplamak Eğriler için beş farklı her embriyo sarısı hücre bölgedeki gelin ölçümleri.</li>
		<li>Tc hesaplamak için her F-h eğri doğrusal en uygun küçük kareler tarafından için. İstatistiksel analiz, kortikal gerginlik Tc hesaplanan farklı F-h eğrileri ortalama gerekir için.</li>
	</ol></li>
	<li>Korteksin visko elastik özellikleri (Reolojisi) düşük genlik uygulayarak ölçmek (100 nm) multifrekans salınım AFM sırasında değişik Frekanslar25sinüsoidal dalgalar oluşur.
	<ol>
<li>Frekans etki alanından kuvvet girinti eğrileri bir etkili karmaşık modülü g*(ƒ) hesaplamak: g * (f) = [F(f) / h(f)]- IFB (5) Burada hayali birimdir ve frekans (f) spectra kuvvet ve girinti F(f) ve h(f) vardır. b için yüzeye uygulanan salınım çıkarılan konsol üzerinde yapışkan sürükle düzeltmedir.</li>
		<li>Gerçel ve sanal içine ayrı g*(ƒ) : g * (F) = g' (f) + IG'' (f)          (6) em > g'(f) elastik modül ve elastik enerji ölçüsü depolanan ve salınım döngüsü kurtarıldı. g'' (f) olduğu için harcanmış enerji hesapları viskoz modülü.</li>
		<li>Katı gibi bir dizinin sağlar kaybı tanjantı hesaplamak (< 1) veya sıvı benzeri (> 1) malzemenin, davranış olarak: g'' (f) / g' (f)          (7) Not: Bu tür ölçüm, parametreleri ayıklamak mümkün mü nasıl viskoz gösteren ve nasıl elastik Problu malzemedir. B biraz yüzeye konsol sonu mesafe bağlı olsa da, çok düşük değerler gverilen ´´ sarısı tarafından sergilenen ( 2D rakam aşağıda görmek) hücre, b küçük değişimler ihmal edilebilir bir etkiye sahip ölçümleri29.</li>
	</ol></li>
</ol>3. parçacık izleme Microrheology
<ol><li>
Parçacık mikroenjeksiyon sarısı hücre içine gerçekleştirmek
	<ol>
<li>(Bkz. Tablo reçetesi) bir yatay micropipette puller ve kapiller borosilikat cam kullanarak özel microneedles imal.<ol>
<li>1.00 mm, bir iç çapı 0,58 mm ve 10 çektirmenin ayarlar kullanılarak cm uzunluğunda bir dış çapı var microneedles hazırlamak: Basınç: 500; Isı: 510; Çekme: 65; Hız: 25; Zaman: 50.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bir enjeksiyon petri kabına plaka özel yapılmış kalıpları ( Tablo malzemelerigörmek) istihdam embriyo orta yatakta bir % 1'özel düz girinti şerit oluşturarak hazırlayın.<ol>
<li>Kalıpları ters çevirin ve sıvı özel jel üstüne koyup ve jel katılaşmış bir kez kalıpları çıkarın. Özel bir diseksiyon stereomicroscope 1.2 X büyütme, altında kalıp tarafından yapılan oluklar içine embriyo pipette. Not: Genişlik ve tasarım kalıpları kendi kendini hizalamak embriyo etkinleştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Önce enjeksiyon, enjeksiyon (yüzey gerilimi embriyo/koryon enjeksiyon sonra kaldırırken için iğne yapışmasını önler) kolaylaştırmak için orta neredeyse tamamen kaldırın.</li>
		<li>Floresan nano tanecikleri microinject (RADIUS bir = 100 nm, Tablo malzemelerigörmek) embriyo sarısı hücre (şekil 3A) bitkisel bölümünde (1:1, 000) suda seyreltilmiş.</li>
		<li>Micropipette hassas micromanipulators ile ayarlamak ve zaman ve basınç kontrol eder (bkz. Tablo reçetesi) ile otomatik bir microinjector boncuk enjekte. Arasında 10 ve 20 psi basınç ayarlı.</li>
		<li>Boncuk çözüm enjekte önce enjekte etmek için birim kalibre (0,5 nL) 1 x 0,01 mm sahne mikrometre ile teslim tarafından microinjector damlacık boyutu ölçerek ( Tablo reçetesigörmek).</li>
		<li>Oda sıcaklığında yapılan enjeksiyonlar sırasında embriyolar görselleştirmek için diseksiyon stereomicroscope 1.6 X büyütme istihdam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Termal dalgalanmaları kaydederek sarısı viskoelastik davranışını değerlendirmek
	<ol>
<li>Dechorionate olarak microinjected embriyo adım 2.1 ve % 0,5 düşük erime noktası özel 30 ° C'de embriyo orta çözümde katıştırmanız Daha sonra onları ( Tablo malzemelerigörmek) cam alt tabakaları bana aktarın ve yönlendirmek ve özel hala sıvı olduğunda onları coverslip doğru itin. Not: özel oda sıcaklığında katılaşır, embriyo yansıması için hazır olduğunda.</li>
		<li>Cam alt levha confocal ters mikroskop 2 h sahnede mikroenjeksiyon sonra monte embriyo yerleştirin. Nano tanecikleri 26 görüntülerini yakalamak bir ters confocal mikroskop Standart ticari mikroskop bilgisayar yazılımı istihdam içinde oda sıcaklığında 63 X amacı ile 25 Hz örnekleme hızında s (piksel boyutunu 166 = nm, her 40 ms yakalanan görüntüleri).</li>
		<li>Parçacıklar cisimlerin konumunu hesaplamak ve açık kaynak ImageJ yazılım (şekil 3B) TrackMate eklentisi ile zaman içinde onların yörüngeleri tanımlayın.</li>
		<li>Her bir parçacık özel yazılım6,30 ile iki boyutlu ortalama kare deplasman (MSD) hesaplamak: < Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2>           (8) Not: Burada t geçen süre ve gecikme süresi. Bir saf viskoz sıvı viskozitesi (ν) göre Stokes-Einstein ilişki MSD ters artar: < Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9) T mutlak sıcaklık nerede.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hernandez-Vega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cortical+tension+drives+zebrafish+epiboly+movements.">Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements.</a> EMBO J. 36, 25-41 (2017).</li><li>Brodland, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+force+microscopy+reveals+the+mechanics+of+ventral+furrow+invagination+in+Drosophila.">Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).</li><li>Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+up+is+stressful:+biophysical+laws+of+morphogenesis.">Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish.">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).</li><li>Koser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+is+critical+for+axon+growth+in+the+developing+brain.">Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain.</a> Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+of+living+cells:+principles+and+applications.">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>de Pablo, P. J., Carri&#243;n-V&#225;zquez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Biological+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy.">Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).</li><li>Roca-Cusachs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+passive+and+adhesion-activated+neutrophils+probed+by+atomic+force+microscopy.">Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).</li><li>Evans, E., Yeung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+viscosity+and+cortical+tension+of+blood+granulocytes+determined+by+micropipet+aspiration.">Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration.</a> Biophys J. 56, 151-160 (1989).</li><li>Fabry, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+scale+and+other+invariants+of+integrative+mechanical+behavior+in+living+cells.">Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).</li><li>Kashef, J., Franz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+methods+for+analyzing+cell-cell+adhesion+in+development.">Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development.</a> Dev Biol. 401, 165-174 (2015).</li><li>Chevalier, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+micromechanical+properties+of+embryonic+tissues.">Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues.</a> Methods. 94, 120-128 (2016).</li><li>Reichlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+native+coronary+artery+endothelium+in+situ+and+in+cell+culture+by+scanning+force+microscopy.">Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy.</a> J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).</li><li>Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+osteon+and+trabecular+bone+measured+by+nanoindentation.">Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation.</a> J Biomech. 31, 21 (1998).</li><li>Grant, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+characterisation+and+biomechanical+analysis+of+the+sclera+by+atomic+force+microscopy.">Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy.</a> J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).</li><li>Efremov, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+living+and+fixed+Xenopus+laevis+embryos.">Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos.</a> Micron. 42, 840-852 (2011).</li><li>Henkels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Mechanical+Variation+Reveals+Critical+Role+for+Rho+Kinase+During+Primitive+Streak+Morphogenesis.">Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis.</a> Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).</li><li>Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+in+zebrafish+--+all+just+about+adhesion?.">Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion?.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+gastrulation:+cell+movements,+signals,+and+mechanisms.">Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms.</a> Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).</li><li>Campinho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension-oriented+cell+divisions+limit+anisotropic+tissue+tension+in+epithelial+spreading+during+zebrafish+epiboly.">Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly.</a> Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).</li><li>Fischer-Friedrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+surface+tension+and+internal+pressure+generated+by+single+mitotic+cells.">Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells.</a> Sci Rep. 4, 6213 (2014).</li><li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+principles,+practices,+and+prospects.">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+of+human+lung+epithelial+cells+measured+by+atomic+force+microscopy.">Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).</li><li>Jorba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Micromechanical+Properties+of+the+Extracellular+Matrix+of+Soft+Tissues+by+Atomic+Force+Microscopy.">Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy.</a> J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).</li><li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+atomic-force+microscope+tips.">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).</li><li>Lomakina, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+and+measurement+of+neutrophil+indentation.">Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation.</a> Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+Microrheological+Measurements+of+Soft+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy+for+the+Hydrodynamic+Drag+on+the+Cantilever.">Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever.</a> Langmuir. 18, 716-721 (2002).</li><li>Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+single-cell+micromechanics+in+vivo:+the+microrheology+of+C.+elegans+developing+embryos.">Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos.</a> Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).</li><li>Kalwarczyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viscosity+of+complex+liquids+and+cytoplasm+of+mammalian+cells+at+the+nanoscale.">Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale.</a> Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).</li><li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+oscillations.+A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation.">Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (2014).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation.">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508, 392-396 (2014).</li><li>Johansen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+micromanipulation+of+nanoparticles+and+cells+inside+living+zebrafish.">Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish.</a> Nat Commun. 7, 10974 (2016).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları bildirin.

İşte malzeme özellikleri ve Zebra balığı sarısı hücre epiboly sırasında bazı biyomekanik parametreleri kolayca AFM ve nano tanecikleri microrheology tarafından tahmin edilebilir olduğunu göstermektedir.
AFM hücre ve dokularda fizyolojik şartlarda4,5,25,28rheological özelliklerini almak için ediyor sağlam geliştirmek için AFM uygulamak için bir ...

Morfogenetik süreçleri biyomekanik kontrolünü altta yatan fiziksel ilkeleri büyük ölçüde tanımsızdır. Biyomekanik çalışmalar moleküler ve hücresel düzeyde önemli ivme toplanıyor, doku/organizma düzeyinde biyomekanik parametreleri keşfi onun bebeklik iken. Hidrodinamik regresyon1 veya Video kuvvet mikroskobu2 araştırmacılar lazer mikrocerrahi3veya daha az müdahaleci Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) Disosiye hücreleri4 aktif ve pasif Kuvvetleri ayırt etmek için izin ver veya vivo 5 veya nanopartikül microrheology6 mendil'ın mekanik özellikleri ve yanıtları beklentisiyle izin verir.
AFM yüzey pürüzlülüğü ve konsol ipuçları temas üzerine saptırma uyum Problu yüzey7ile çözme atomik yüksek çözünürlüklü üç boyutlu topografik bir tekniktir. AFM istihdam farklı yöntemleri yüzey özellikleri, sürtünme, yapışma kuvvetleri ve çeşitli malzemelerin visko elastik özellikleri ölçme de dahil olmak üzere araştırma için geliştirilmiştir. Son zamanlarda, AFM biyolojik örneklerin mekanik özellikleri hakkında bilgi almak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, AFM non-invaziv karmaşık kesme modülü tek hücreleri ile bilinen bükme sürekli8konsol için bağlı bir mikro uç salınım girintili yazımları uygulayarak ayıklayabilirsiniz. Bu ortaya çıkan Kuvvetleri sonucuna izin veriyor. Henüz, ve farklı yöntemleri izin rheological veri ve mekanik özellikleri tek tek hücreleri ayıklama AFM benzersiz değildir (Örneğin, Micropipette aspirasyon9, manyetik sitometresi (MTC)10büküm veya uniaxial çekme dayanımı «««test)11.
Henüz, bu roman metodolojileri uygulamaya karmaşık morfogenetik işlemleri basit değildir. Yumuşak küçük (µm mm), embriyonik dokuların mekanik özelliklerini belirlerken karşı karşıya ana sorunlar nelerdir (102 - 104 Pa aralığı) ve malzeme12doğası visko-elastik (Saat-bağımlı olayları veren artış). Bu nedenle mekanik özellikleri (sertlik, viskozite, yapışma) belirlenmesi için embriyo ve gelişmekte olan organizmalar belirli durumunda istihdam yöntemleri uyum önemlidir. İki önemli konu göz önüne geliştirme çalışmaya rheological yaklaşımlar analiz ederken alınması gerekir: müdahaleci bir girişimi engellemek için ve kolay erişilebilirlik sağlamak için. Bu senaryoda, micropipette aspirasyon, MTC ve gerilme test sınırlamalar sergi. İlk durumda, bir hücrenin muzdarip yüksek deformasyon onun fizyolojik ve mekanik özellikleri9değiştirebilir. İkinci durumda, sıkıca uygulanan stresleri sitoiskeleti yerel olarak deforme emin olmak için bir substrat için deneysel doku uygun gerek Ayrıca etkileri hücre harekete geçirmek durum ve, dolayısıyla, onların mekanik özellikleri10 tanıştırır mısın . Son, uniaxial gerilme yaklaşımlar gelişmekte olan organizmalar ve erişilebilirlik11geometri tarafından sınırlıdır.
AFM doğal çevrenin hantal örnek herhangi bir hazırlık yapmadan doğrudan içinde biyolojik örnekler incelenmesi verdiğinden daha iyi gelişim süreçleri çalışma için uygun görünüyor. Ayrılma embriyonik dokuların genellikle zor olduğu için Ayrıca, AFM probları indirimli boyutu sınırlama olmaksızın orta (sulu veya sulu olmayan), örnek ısı veya kimyasal türünü seçiminde çok yönlü yüksek derecede sağlar kompozisyon örnek. AFM büyük etki alanlarına uygulanması ve ölçekler saat için çok yönlü ve farklı gelişim aşamalarında veya fizyolojik şartlarda dokuların malzeme özelliklerini almak için istihdam edilmiştir. Bütün yerel doku arterler13 ya da kemik14 topografik açıdan ve bazı durumlarda, sklera gibi okudu gibi mekanik özellikleri de erişim tarihi15olmuştur. Topografya ayrıca canlı embriyolar Xenopus16görselleştirme, örneğin, hücre düzenlenmesi sırasında morfogenez izin içinde keşfedilmeyi. En son ve kapsamlı örnek hazırlama protokoller farklı gelişim sürecinde mekanik parametreler belirlemek için geliştirilmiştir. Nanoindentation haritalar yerel sabitlenmemiş doku bölümlerinde piliç embriyonik sindirim sistemi11için oluşturulan; gastrulating Zebra balığı embriyo4den izole tek tek ektoderm, mesoderm ve endoderm progenitör hücreler için alınan ya da mekanik özellikleri; sertlik ölçümleri epiblast ve ilkel çizgi explants üzerinde kuş embriyo17için gerçekleştirilen; ve sertlik degradeleri doğrudan Xenopus5embriyonik beyinde tanımlanan farklı bir desen.
AFM embriyonik gelişim keşfetmek için uygulamak için önemli bir nitel sıçrama basit erişilebilir morfogenetik süreçleri yaklaşan gelebilir. Zebra balığı epiboly içinde sınırlı bir küresel alanda blastoderm genişleme birkaç saat içinde doğrudan farklı dokuların koordine bir temel ve korunmuş, olaydır. Zebra balığı epiboly (küresel sahne) başlangıcında, hücreleri, zarflama Katmanı (EVL), yüzeysel tabakası hayvan pole büyük sarısı sinsisyal cepten oturan embriyo merkezli blastomeres yarı küresel bir kap kapsar. Epiboly EVL, kortikal bitkisel ward genişlemesi derin hücreleri (DCs) blastoderm ve sarısının etrafında sinsisyal sarısı hücre (E-YSL) dış tabakası oluşur. Epiboly EVL ve DCs bitkisel pole18,19,20kapatılması ile sona erer. Nasıl ve nerede Kuvvetleri epiboly sırasında oluşturulur ve nasıl genel olarak birleştiğinde değil henüz1,21açıktır.
Burada ayrıntılı olarak nasıl pasif mekanik doku özellikleri Zebra balığı sarısı ilerlemesinde epiboly sırasında in vivohücre anlaması için AFM uygulanacağını açıklar. Bunu yapmak için küçük mikroküreler probları gibi AFM cantilevers bağlı çalıştırmaya başladık. Bu kesin yerel bilgi üniform olmayan sarısı hücre yüzeyine içinde ve tensional gradyanlar ve onların dynamics zaman içinde çalışmaya alınmasını sağlar. Alternatif AFM kama cantilevers22kullananların gibi yaklaşımlar, değil yeterince kesin yerel veri render olacaktır. Konsol sonundaki örnek boyutundan daha büyük bir kama yapıştırmak için çok dikkatli işleme beceri gerektirir, kama tekniği iyi embriyo problama için uygun değildir (~ konsol uzunluğu daha büyük 2'ye katlanmış) mekaniği.
Modelleme ve nitel ve nicel bir şekilde hücreleri visko elastik özelliklerini karakterize geliştirilmiş onların biyomekanik için anlayabileceksiniz. Biyomekanik açıdan epiboly ve kortikal gerilim ölçümleri ve AFM tarafından çıkarılan dynamics, sadece talep bilgi anlamak önemlidir; Böylece doku biyofiziksel özellikleri hakkında bilgi için gerek yoktur. Bu bilgileri ayıklamak için çeşitli hücre Reolojisi teknikler geliştirilmiştir yıllar içinde farklı hücre türleri farklı fizyolojik şartlarda23altında karakterize için. AFM, MTC ve optik cımbız (OT) içerir. Bu yöntemler, ancak, embriyo veya organları ölçekte mezoskopik analizleri için yetersiz kanıtlanmıştır. Alternatif olarak, başarıyla nanopartikül izleme microrheology6 in vivo rheological ölçümler için adapte edilmiştir. Bu teknik bireysel parçacıkların Brown talebiyle analiz eder ve yerel micromechanical özelliklerini tanır.
Birlikte AFM ve nanoparçacık microrheology epiboly sırasında kortikal tensional dynamics tanımı ve yumurtalı iç mekanik özellikleri sağlar. Bu bilgiler tamamen Anizotropik stres EVL deformasyon yanıt farklılıkları bir sonucu olarak gelişir ve E-YSL korteks izotropik actomyosin daralma için sarısı sitoplazmik Katmanı (GKB) için gerekli bir model onayladığı EVL ve epiboly ilerleme1yönlü net hareketi.

<table><tbody><tr><td>Inverted optical microscope</td><td>Nikon</td><td>TE2000</td><td>Visualization of the sample and AFM cantilever</td></tr><tr><td>Atomic force microscope (AFM)</td><td>Custom made</td><td>-</td><td>Any commercialized AFM could be employed</td></tr><tr><td>Inverted Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Nanorheology data collection</td></tr><tr><td>Agarose D1 Low EEO</td><td>Conda</td><td>8016.00</td><td>Casting embryos</td></tr><tr><td>Ultrapure LMP Agarose (low melting)</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>Securing embryos</td></tr><tr><td>Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds</td><td>World Precision Instruments</td><td>Z-MOLDS</td><td>Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed</td></tr><tr><td>Dumont 5 Forceps</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td>1.5 mm diameter</td></tr><tr><td>Si&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; cantilever</td><td>Novascan</td><td>PT.GS</td><td>Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 &amp;micro;m diameter and k=0.01 N/m</td></tr><tr><td>Fluorescent nanoparticles</td><td>Life Technologies</td><td>FluoSpheres F8811,</td><td>For tracking nanorheology</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000</td><td>Fabricating tailored microneedles</td></tr><tr><td>Borosilicate capillary glass</td><td>Warner Instruments</td><td>G100TF-4</td><td>Fabricating tailored microneedles</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td>Manipulating the micropipette</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td>Controlling injection time and pressure</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>DFC365FX</td><td>Visualization of the embryos during injection</td></tr><tr><td>Analysis Software</td><td>MathWorks</td><td>Matlab</td><td>Analyzing AFM and particle tracking data</td></tr><tr><td>Zebrafish</td><td>AB and TL wild type</td><td>-</td><td>Strains employed for embryo collection</td></tr><tr><td>Glass Bottom Plates</td><td>Mat Tek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>Mounting embryos for nanorheology data collection</td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>FST</td><td>29025-02</td><td>Measuring injection volume</td></tr></tbody></table>

afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell

Dokularda gelişen spatio-temporal organizasyon doğrudan faktörler elucidating birincil amacı kalkınma insan biridir. Çeşitli önermeler hücre ve dokuların farklı gelişim ve morfogenetik süreçlerde kronolojik zamanmekansal kuruluşlarındaki mekanik özelliklerinin anlayış önemli katkıları olmuştur iddiasında. Ancak, malzeme özellikleri ve tensional parametreleri içinde vivoölçmek için güvenilir ve erişilebilir araçları eksikliği nedeniyle, bu hipotez doğrulayarak zor olmuştur. Burada istihdam Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) ve parçacık sağlam Zebra balığı embriyo sarısı hücresinin mekanik özelliklerini epiboly sırasında miktarının amacı ile izleme yöntemleri mevcut. Epiboly olan çalışma embriyo şeffaflık tarafından yönetilir bir erken korunmuş gelişimsel bir süreçtir. Doku mekaniği etkileyebilecek müdahaleci müdahaleler üstesinden gelmek bu yana bu yöntemleri uygulamak basit, güvenilir ve yaygın olarak uygulanabilir. Basit ve bir strateji montaj örnekleri, AFM kayıt ve nanoparçacık enjeksiyonları ve izleme için uygulandı. Bu yaklaşım diğer gelişimsel kez veya organizmalar bu yöntemler kolayca uyarlanabilir yapar.

Kortikal gerilim ölçümleri Her ölçüm noktası için beş kuvvet-deplasman (F-z) eğrileri AFM tarafından 1 Hz değerinde 5 mikron tepe tepe genliği ile konsol ramping tarafından satın alınan (hız = 10 µm/s) ~ 2 µm maksimum bir girinti kadar. Bu yordam az 20 dk alıyordu ve epiboly ilerleme tarafından etkilenmez. Deneysel her koşul en az 5 embriyo test edildi.
Embriyo sarısı cepten kaydedilen...

Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM ve Zebra balığı embriyo sarısı hücre Microrheology

Malzeme özellikleri ve tensional parametreleri içinde vivo ölçmek için Araçlar eksikliği onların rolleri geliştirme sırasında doğrulama engeller. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) ve mekanik özellikleri bozulmamış Zebra balığı embriyo sarısı cep epiboly sırasında ölçmek için nanopartikül izleme çalıştırmaya başladık. Bu, güvenilir ve yaygın olarak uygulanabilir müdahaleci müdahaleler kaçınarak yöntemlerdir.

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

afm-and-microrheology-in-the-zebrafish-embryo-yolk-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K Görüntüleme.  Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Malzeme özellikleri ve tensional parametreleri içinde vivo ölçmek için Araçlar eksikliği onların rolleri geliştirme sırasında doğrulama engeller. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) ve mekanik özellikleri bozulmamış Zebra balığı embriyo sarısı cep epiboly sırasında ölçmek için nanopartikül izleme çalıştırmaya başladık. Bu, güvenilir ve yaygın olarak uygulanabilir müdahaleci müdahaleler kaçınarak yöntemlerdir.

Video: AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Gelişim Biyolojisi

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biyoloji

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Nörobilim

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

<meta charset="utf8"></head><body>Zebra Balığı Embriyoları için Rafine Multiview Işık Tabakası Mikroskobu Protokolü

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Yüksek Çözünürlüklü Çoklu Görüntülü Işık Tabakası Mikroskobu için Zebra Balığı Embriyolarını Monte Etme Stratejileri - Görüntüleme ve Görüntü Yeni

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

AFM ve Zebra balığı embriyo sarısı hücre Microrheology

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri