この研究は、国立衛生研究所の助成金 (R01 DE025985)、アメリカ癌協会の研究学者賞 (RSG-13-383-MPC) にサポートされていました。この作品もによって支えられた米国農務省の (2015-67015-23268 と 2014-67015-21787) とカリフォルニア大学から新しい研究イニシアティブ助成金からの助成金・ デイヴィス。

注意: この手順で使用される細胞感染ウイルスを含んでいる、注意、レベル 2 BSL 施設以上時だけ進みます。
1. セルの準備とメンテナンス
<ol><li>TREx K-RTA BCBL 1 細胞の培養 (または別 KSHV 感染 PEL セルライン) 15% ウシ胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン ストレプトマイシン グルタミン溶液添加 RPMI1640 培地で。</li>
	<li>継続的に成長し、1:4 の比率は、2-4 日おきにセルを分割するように 5% 二酸化炭素 (CO2)、37 ° C で細胞を成長します。</li>
	<li>良い細胞増殖と形態は、それ以外の場合に細胞培養を再起動するか、または細胞培養条件を調整するは、勧めを確認する毎日光顕微鏡による培養細胞を監視します。</li>
</ol>2. チミジン同期と溶解誘導
<ol><li>10 cm シャーレで TREx K-Rta BCBL 1 細胞作りたてメディア (メディアの 1 x 106セル/2 mL)</li>
	<li>200 mM チミジンを追加 (最終濃度: 2 mM) 皿にミックスし、18 時間孵化させなさい。</li>
	<li>遠心分離機 500 x g に 5 分のセル洗浄と滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x セル、再び、遠心分離機、作りたてメディアで細胞を再懸濁します。3 洗浄の合計に対して繰り返します。作りたてのメディアで再懸濁します。</li>
	<li>8 h に S 段階を終了するセルを許可します。</li>
	<li>チミジンを追加 (最終濃度: 2 mM) をミックスして 16 時間孵化させなさい。</li>
	<li>遠心分離機 500 x g に 5 分のセル洗浄と滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x セル、再び、遠心分離機、作りたてメディアで細胞を再懸濁します。3 洗浄の合計に対して繰り返します。作りたてのメディアで再懸濁します。</li>
	<li>ウイルス再活性化を誘導するには、細胞培養に 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA、最終濃度 20 ng/mL) とドキシサイクリン (DOX、最終濃度 100 ng/mL) を追加、ミックス、4 時間インキュベートします。K Rta 誘導カセットなしセルライン、TPA (最終濃度 20 ng/mL およびナトリウム酪 (1 mM)) を使用して再活性化を刺激するため。</li>
	<li>遠心分離機 500 x g に 5 分セル洗浄と滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x セル、再び、遠心分離機および完全な培地で細胞を再懸濁します。3 洗浄の合計に対して繰り返します。完全な文化メディアで再懸濁します。</li>
	<li>24 h に成長する細胞を許可します。</li>
</ol>3. 固定・透過
メモ: 先に進む前に必ず固定ソリューション (DEPC 処理 PBS で 3.7% ホルムアルデヒド)、ジエチル pyrocarbonate 処理リン酸緩衝生理食塩水 (DEPC PBS)、グリシン DEPC PBS (グリシンの最終濃度: 100 mM) および permeabilizating 溶液 (50%アセトン、50% メタノール) を用意しています。通常、各スライドが少なくとも 50 万の細胞を必要とする、必要に応じて乗算し、細胞が健康ではない場合に特にを背面に余分なセルが含まれています。
<ol><li>1.5 mL 遠心チューブに細胞を収集します。</li>
	<li>3 回で 1 mL の滅菌の DEPC PBS セル 200 x g. 洗浄で 2 分間細胞を遠心分離機します。1.2 mL の DEPC PBS に再懸濁します。</li>
	<li>6 ウェル プレートの底に coverslips (実験のセットアップによって決まります) の適切な数を配置します。</li>
	<li>セルに各 coverslip DEPC PBS 混合物の 200 μ L をピペット、少なくとも 50 万の細胞が各スライド上にあることを確認します。2 分のために解決の細胞し、細胞の薄い層だけを残して余分な DEPC PBS を吸引します。このプロセスで、削除するセルは正常です。 注意: PFA は有毒である、適切な保護具を着用します。</li>
	<li>慎重に各カバー スリップするソリューション (DEPC PBS で 3.7% ホルムアルデヒド) の修正の 1 つの mL を追加します。10 分間を修正するセルを許可します。</li>
	<li>Coverslips DEPC PBS で 3 回洗います。</li>
	<li>慎重にグリシン DEPC PBS の 1 mL を追加 (グリシンの最終濃度: 100 mM) 各カバー スリップします。5 分急冷するセルを許可します。</li>
	<li>5 分のシェーカーで 1.5 mL の DEPC PBS のいずれかの場所を追加または 1 分吸引超過の DEPC PBS のためしっかりと、優しく手を振る。セルを破壊しないように注意します。3 洗浄の合計のためには、この手順を繰り返します。</li>
	<li>慎重に構造の各カバー スリップに (50% アセトン、50% メタノール) ソリューションの 1 つの mL を追加します。15 分間 permeabilize セルを許可します。 注: この時点で、coverslips はもはや一週間以上の-20 ° C のフリーザーで格納できます。凍結を避けるか、画像の品質が急激に低下、冷凍庫に費やされる時間を最小限に抑えます。確認するときにセルのまま冷凍庫ウェットとメタノールまたはアセトンと彼らは正しく冷凍庫から取り出した後 DEPC PBS で補給できるように屋根付き。</li>
	<li>5 分のシェーカーで 1.5 mL の DEPC PBS のいずれかの場所を追加またはしっかりと振るが手に優しく 1 分超過の DEPC PBS を吸引、セルを破壊しないように注意してください。3 洗浄の合計のためには、この手順を繰り返します。</li>
</ol>4. IFA と RNA 魚
注: 魚 RNA プローブのラベル付けと準備について: の K-Rta 959 塩基対、31 の異なるプローブであるイントロンが生成され、20 塩基対、各 GC を含む約 50% の満足していました。プローブの作業、在庫ソリューションであった 100 μ M 及び 2.5 μ M の濃度に避けよう。
<ol><li>実験に必要な情報または区別のラベルのいくつかの並べ替えを持つ顕微鏡スライド ラベルを付けます。</li>
	<li>湿ったペーパー タオルでヒートシール可能なプラスチック製の容器の底を並べ。</li>
	<li>
一次抗体溶液を調製 (1.5 μ L ラナ抗体、0.75 μ L の RNA Pol II 抗体、ベーカーの 3 μ L の酵母まで 30 μ L の DEPC PBS、tRNA) とそれぞれの coverslip の存在のためのレシピを乗算します。各ラベル付き顕微鏡スライド上に一次抗体ソリューションの場所 30 μ L。
	<ol>
<li>まず興味の一次抗体を滴定し、最適な量を使用します。必ず使用して精製された IgG 血清 (腹水) が RNase の大量を含んでいる可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ラベル付き顕微鏡スライド上に coverslip (ソリューションを直面しているセル) を置き、湿ったペーパー タオルでコンテナーにスライドを移動します。気泡を導入することに注意してください。プラスチック製のラップとコンテナーの外装をカバーします。1 h の 37 ° C に設定インキュベーターにコンテナーを移動します。</li>
	<li>(2 x 生理食塩水のナトリウム クエン酸バッファー (SSC) (最終)、10% ホルムアミド、90% DEPC dH2O) 魚洗浄バッファーを準備します。</li>
	<li>交配バッファー x 2 を準備 (4 x SSC、20% デキストラン硫酸)。</li>
	<li>二次抗体と魚イントロン プローブ バッファーを準備 (交配バッファー (Hyb バッファー x 最終 1) x 2 の 20 μ L、パン酵母の 4 μ L tRNA (最後の 10%)、ホルムアミド (最後の 10%)、イントロン K Rta プローブの 4 μ L (最終的な 125 nM)、0.8 の二次抗体、DEPC dH2 μ g40 μ L まで O)。必要なすべてのスライドのためのレシピを乗算します。</li>
	<li>インキュベーション後、3 回 5 分 6 ウェル プレートで DEPC PBS のセルを洗浄します。</li>
	<li>3 回各 5 分の魚洗浄バッファーで洗浄します。第二に抗体とイントロンのプローブ (ステップ 4.7) の混合物の準備完了するまで魚洗浄バッファーの coverslip を維持します。</li>
	<li>きれいなガラスのスライドは、一次抗体の孵化の交配のために使用されます。</li>
	<li>二次抗体とスライド グラスの上にソリューションを含む魚イントロン プローブの場所 40 μ L。</li>
	<li>泡を導入するしないように注意をする、バッファー上に下向きセル側でスライド上に細胞を coverslips を配置します。</li>
	<li>底に湿ったペーパー タオルでプラスチックの容器にスライドを配置します。最初のラップとし、アルミ箔とプラスチックの容器をラップします。</li>
	<li>16-24 h 37 ° C でスライドを持つコンテナーを孵化させなさい。</li>
	<li>インキュベーション後、慎重にスライド、coverslip スライド ガラスの端から 6 ウェル プレート、上向きに戻す、3 回 5 分 6 ウェル プレートで魚洗浄バッファーを持つセルを洗浄します。</li>
	<li>2 回で 2 セルを洗浄して x SSC。</li>
	<li>2 に DAPI (1:1, 000) を追加 x SSC し、室温で 5 分間座ることができます。</li>
	<li>2 回で 2 セルを洗浄して x SSC。</li>
	<li>交配用スライド ガラスをきれいにしガラス スライド上にソリューションを装着の 10 μ L を追加します。</li>
	<li>Coverslips フェイス ダウンをマウント ソリューションを配置します。気泡を導入することに注意してください。</li>
	<li>研究所の組織と細胞をスカッシュに触らない、余分なマウント ソリューションを注意深く取り外します。</li>
	<li>マニキュアを使用して、coverslips の端のまわりの十分な層を適用して乾燥することができます。</li>
	<li>蛍光顕微鏡を実行に進みます。</li>
</ol>5. 3 D 蛍光顕微鏡
注: プロトコル使用蛍光顕微鏡システムの種類で異なりますが、次の手順、定量分析のための最適な画像データの取得を保障を助けます。
<ol><li>固定サンプルを前処理し、イメージング中に蛍光退色を遅延する耐フェード メディアでマウントします。</li>
	<li>全体のセル (またはセルの核) をキャプチャすることができます (60 X 1.42 N.A 油浸型レンズなど)、高品質の目的を使用して、ビューのフィールドで。</li>
	<li>正と負のコントロールのサンプルを使用して、それぞれの蛍光カラー チャンネルの露出パラメーター (例えば、励振電力、露光時間) を設定します。蛍光画像を取得します。 注: のみ 1 つの蛍光ラベルを含む肯定的な制御サンプルは、「クロストーク」カラー チャンネル間のレベルを決定するのにも使用ください。画像固定細胞標本の退色を最小限に抑えるため、(わずかにより長い露光時間) と蛍光励起電力を削減できます。</li>
	<li>イメージングのプロトコルを確立すると、維持同じ露光パラメーター研究のすべてのサンプルに対する一貫性のある-ので、画像データを正確に分析および比較が可能します。</li>
	<li>買収後の画像処理と 3次元復元を実行します。特定 RNA 魚信号 (赤) で K Rta 成績証明書、ラナ分子蛍光抗体法 (緑) と核クロマチン (該当する場合) 染色 DAPI (青)。 注: K Rta とラナが共同クラスターである細胞核の領域従ってウイルス転写工場および複雑なレプリケーションに関連する考えられています。</li>
</ol>

<ol>
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この論文の著者には、金融関係や競合する利害の衝突があります。

異常な状況に合わせて変更することができますプロトコルのいくつかの側面があります。固定・透過バッファーの選択を変更することも。固定バッファーのパラホルムアルデヒドも効果的で、透過性のエタノールを使用ことができます。
ホルムアルデヒドがウシ血清アルブミン (BSA) の不在で抗体を無効にするを防ぎますが、グリシンの PBS のステップをスキップできま?...

それは核の時空間の組織が真核生物で細かく調整された遺伝子の発現を調節する際に重要な役割を果たしていることがますます明らかになっています。ほとんどのティッシュ特定の遺伝子は多くの染色体に分散されているし、調整方法1特定の刺激に応答するために同期的に規制する必要があります。細胞は、核の特定の空間1遺伝子とそのシスのコンポーネントをまとめるための方法としてアクティブなクロマチン ハブ (ACH) を構築します。
それも実証されている様々 な研究によって核思われます非常に密な粘性が、生理活性分子を経由できること核より迅速に拡散2を経由。この一時的なプロパティは、結果としてほとんどの DNA 結合タンパク質 'ジャンプ' 結合により、高い適応性と汎用性の高い核2原子力の分野の周り自分の道を感じるサイトへサイトのバインドから。
核内の分子の動的挙動がこの、にもかかわらず核体膜なしなど (ただしこれらに限定されない) 核小体、カハール体および前骨髄球性白血病核体 (PML の-NB) がまだ存在します。それはタンデム DNA 繰り返し (仁)、rRNA (仁) と coilin (カハール体) など PML タンパク質などの様々 な蛋白質 (PML の-NB) これら構成要素一緒に3,4,5 を保持します。.これらの構造と転写工場など他の集会だけでなく必要なコンポーネントのローカル集中を高めるが、またタンパク質や核酸最終的に作成するそれらの内の組成を調節する足場として、効率的な細胞機能6中央のサイト。
核構造のフォームは、エピジェネティクス研究に豊富な情報を提供しますいつ、どこの可視化。ウイルス学の観点から KSHV などの潜伏感染したウイルスの再活性化大幅核の風景とウイルス遺伝子を細胞の遺伝子から主に転写を最終的にシフトする核酵素の分布を変更するには完全に機能ウイルス子孫7、8を生成します。KSHV はどのようにウイルスの遺伝子発現を促進する細胞遺伝子式機械を操作できますか。そのような情報は、細胞特異的な遺伝子発現制御機構に光を当てることができるも。
他のヘルペス ウイルスは、同様 KSHV 複製と遅延と呼ばれる 2 つのライフ サイクルがあります。KSHV は遅延関連遺伝子9,10を除いて、式の沈黙で、ほとんどのウイルスの遺伝子の潜伏段階で主に存在します。生成 KSHV 待ち時間中に待ち時間は恒常とウイルスのゲノムを縛り、人間の染色体11ウイルス クロマチンをテザー核抗原 (ラナ) を関連付けられています。ラナのウイルスのゲノムとの親密な関係のため、IFA および DAPI を使用して染色し、ウイルス エピソームがホスト クロマチンに関連していた検索することが可能です。
単一 episome レベルおよび感染細胞内の他のウイルスのエピソーム関連付けで KSHV を再活性化を勉強するには、手段を使って、積極的にその場でウイルス クロマチン転写を設置します。したがって、ラナとイントロン RNA 魚と RNAPII を対仏投資庁に結合されたは KSHV K Rta のキーのウイルス蛋白質のイントロン領域 (泉谷ラボの最新出版物8シーケンスを見つけることができます正確なプローブ) にバインド魚 RNA プローブを生成することによって不可欠と KSHV 再活性化-それは識別すること十分な転写が取っていた実際にどこの場所8,11,12,13,14,15.このイントロン RNA 魚の技術すぐに融着接続、細胞質16,17にエクスポートする前に、mRNA が転写されている視覚化することも可能。 にします。
KSHV ホルボールエステル 12-O-Tetradeconoyl-ホルボールエステル-13acetate (TPA) などを含む様々 な化学的刺激によって再びアクティブにできます、酪、さらに KSHV などヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が誘導され、過剰発現による再アクティブ化ウイルスの転写因子、K Rta19。研究者は再活性化18を誘導する前にセルのサイクルを同期することによって正常に KSHV 再活性化の効率を増加しています。したがって、これらの特定の研究は、細胞は二重チミジン ブロック (下記のプロトコル) を使用して、短時間 TPA とドキシサイクリン (Dox) インキュベートに同期されました。これらの実験に利用されている細胞株はドキシサイクリン誘導された K Rta カセットは、cDNA から複製された、K Rta のイントロン領域は含まれませんので、ドキシサイクリンが使用されました。再アクティブ化することが可能だが K Rta 式を誘導 KSHV を使用してのみ、それは、さまざまな異なる生化学的要因により K Rta 式だけがかすかな再活性化刺激20と証明する他の研究者によって証明されています。これらのすべてを組み合わせることで、薬物孵化に時間の短い期間を制限することにより、イメージングの堅牢な過度に人工的ではない KSHV 再活性化が達成されました。
ラナ、RNAPII、ラベリング後 K Rta イントロンととしての DNA は、このペーパーで説明、広視野デコンボリューション顕微鏡を用いた 3 D 蛍光イメージングを行った。イメージング ソフトウェアとの処理の後は、アクティブなウイルス エピソームの空間分布を正しく評価できます。この手法を使用すると、アクティブなクロマチン ハブやその他の核構造の形成の基本的な性質に関する中央の質問を学ぶことができます。同じ規制要素を処理する単一のセルに同じウイルス エピソームを持つ時空間の遺伝子発現制御機構の理解を深めるためのユニークな研究ツールがあります。
異なる時点で固定する複数の細胞標本が、本質的に動的分子プロセスを特徴付けるためのイメージングの制限事項は蛍光分布の微妙なあるいは小規模の変化が検出されているまたは取るに足りないと判断します。これはまれなインスタンスの観察のすべてのセルが同じの微妙な変化を表示されない場合です。したがって、アクティブなウイルスの転写およびその他の核構造の全時空間関係批判的に評価できません固定のイメージングを使用します。これらの技術的な課題に対応するには、最善の方法は、ウイルス エピソームをマークしている生きた細胞をイメージし、時間の経過とともに細胞の主要な酵素の場所に従うことです。

<table><tbody><tr><td>RPMI medium 1650 GlutaMAX</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>Needs to be warmed to 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine (100x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Solution</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Butyrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>Corrosive, toxic, health hazard</td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-5758</td><td>Acute toxicity&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179124</td><td>Flammable, toxic</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemical&amp;nbsp;</td><td>67-56-1</td><td>Flammable, toxic, health hazard</td></tr><tr><td>Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8</td><td>EMD Milipore</td><td>05-623</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleic acid, transfer from baker&amp;rsquo;s yeast (S. cerevisiae)&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9014-25-9</td><td></td></tr><tr><td>Saline sodium citrate buffer 20x (SSC)</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15557044</td><td></td></tr><tr><td>Formamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>295876</td><td></td></tr><tr><td>Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution</td><td>EMD Milipore</td><td>1916C093</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&amp;rsquo;,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>slowFade Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass 22x22</td><td>Matsunami</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr><td>VoloCITY</td><td></td><td>3D imaging software</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/Plus microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr></tbody></table>

functional imaging of viral transcription factories using 3d fluorescence microscopy

遺伝子の空間的で、一時的な規制が適切な遺伝子発現を支配するの不可欠な部分であることが知られています。その結果、核空間内で転写が行われて、いつどこを理解し、エピソーム同じ細胞の核内に感染との関係を視覚化するが有益です。ここでは、蛍光抗体法 (IFA) と RNA の魚をされているに転写してカポジ肉腫関連ヘルペス ウイルス (KSHV) エピソーム総収入を識別します。KSHV 潜時に関連核抗原 (ラナ) を染色によってウイルス エピソームが核内に存在する検索することが可能です。さらに、生産的な伝染の間にだけ表現されるウイルス遺伝子のイントロン領域を対象とする魚 RNA プローブを設計することによって初期の RNA 転写産物に配置できます。この分子プローブの組み合わせを使用して、大規模なウイルスの転写工場の組立を視覚化および分析 KSHV 再活性化中にウイルスの遺伝子発現の空間情報の制御することが可能です。抗 RNA ポリメラーゼ II 抗体の汚損などによる RNA ポリメラーゼ II (RNAPII) の集約と再アクティブ化の間に KSHV 転写関係を視覚化することも 1 つ。

やや弱めのプロトコルを行った BCBL 1 セルを用い、ラナと K Rta RNA のみ染色 (図 1)。この実験では、積極的に転写のウイルス エピソームがあると細胞の人口に KSHV 再活性化刺激への反応の不均一性を調べることが出来ます。図 1の矢印で示されたセル、密接にウイルス エピソーム (ラナでマーク) の分布に一致する領域で異?...

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Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

ウイルスの転写工場は、濃縮されている細胞の RNA ポリメラーゼ II は再活性化の中にウイルスの遺伝子の転写を増加する離散構造です。ここでは、積極的に蛍光染色し、その場でRNA の交配の組み合わせによってウイルス クロマチン核の 3 D 空間での議事録作成のサイトを検索する方法を説明します。

3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

functional-imaging-viral-transcription-factories-using-3d

Research

JoVE Journal

Biology

7.0K ビュー.  University of California, Davis. ウイルスの転写工場は、濃縮されている細胞の RNA ポリメラーゼ II は再活性化の中にウイルスの遺伝子の転写を増加する離散構造です。ここでは、積極的に蛍光染色し、その場でRNA の交配の組み合わせによってウイルス クロマチン核の 3 D 空間での議事録作成のサイトを検索する方法を説明します。

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Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

免疫・感染学

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

生物工学

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Alphaherpesウイルス順行性輸送とスプレッドの生細胞イメージング

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

遺伝子発現のすべての段階でウイルス機能を定量化するためのワクレポーターウイルス

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

生物学

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

蛍光共焦点顕微鏡を用いた単純ヘルペス ウイルス 1 蛋白質の核-細胞質転流の時空間解析

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that enable sensitive and simultaneous labeling of viral nucleic acid and protein. Conventional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) methods are often not compatible with immunostaining. We have therefore developed an imaging approach, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), which enables simultaneous single-cell visualization of DNA, RNA, and protein. Compared to conventional DNA FISH, MICDDRP utilizes branched DNA (bDNA) ISH technology, which dramatically improves oligonucleotide probe sensitivity and detection. Small modifications of MICDDRP enable imaging of viral proteins concomitantly with nucleic acids (RNA or DNA) of different strandedness. We have applied these protocols to study the life cycles of multiple viral pathogens, including human immunodeficiency virus (HIV)-1, human T-lymphotropic virus (HTLV)-1, hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), Zika virus (ZKV), and influenza A virus (IAV). We demonstrated that we can efficiently label viral nucleic acids and proteins across a diverse range of viruses. These studies can provide us with improved mechanistic understanding of multiple viral systems, and in addition, serve as a template for application of multiplexed fluorescence imaging of DNA, RNA, and protein across a broad spectrum of cellular systems.

Presented here is a protocol for a fluorescence imaging approach, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), a method capable of simultaneous fluorescence single-cell visualization of viral protein and nucleic acids of different type and strandedness. This approach can be applied to a diverse range of systems.

ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング

要約

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HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Alphaherpesウイルス順行性輸送とスプレッドの生細胞イメージング

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

遺伝子発現のすべての段階でウイルス機能を定量化するためのワクレポーターウイルス

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

蛍光共焦点顕微鏡を用いた単純ヘルペスウイルス 1 蛋白質の核-細胞質転流の時空間解析

蛍光によるウイルスRNAの検出

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング

要約

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HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Alphaherpesウイルス順行性輸送とスプレッドの生細胞イメージング

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

遺伝子発現のすべての段階でウイルス機能を定量化するためのワクレポーターウイルス

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

蛍光共焦点顕微鏡を用いた単純ヘルペス ウイルス 1 蛋白質の核-細胞質転流の時空間解析

蛍光によるウイルスRNAの検出

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

蛍光共焦点顕微鏡を用いた単純ヘルペスウイルス 1 蛋白質の核-細胞質転流の時空間解析