Основным преимуществом этой технологии является то, что она позволяет быстрое изображение сердца мыши. И его можно использовать для наблюдения за наличием воздушных каналов после генной терапии. Хотя этот метод может дать представление о развитии кардиологии, он также может быть применен к другим системам, таким как неврология и пульмонология.
Как правило, люди будут бороться с этой техникой, потому что монтаж изображения сердца взрослой мыши может быть трудно, и это отличается от других, традиционных методов, таких как конфокальные и перевернутые микроскопии. Поместите непрерывный волновой лазер с тремя длинами волн 405 нанометров, 473 нанометров и 532 нанометров. Затем прикрепите зеркало одно и выровняете его с зеркальной плоскости при 45 градусах к лучу.
Это направит лазер к сплиттеру луча, который образует двустороннюю установку освещения. Затем пройдите луч через фильтр нейтральной плотности диаметром 50 миллиметров, расширительную балку и отверстие диаметром 25 миллиметров, расположенные на 150 миллиметров друг от друга. Перейдите луч через 50-50 пучка сплиттер, помещенный 150 миллиметров от пинхол.
Затем поместите зеркало в два 150 миллиметров от сплиттера луча, на 90 градусов к перемотке вперед, и выровняете его так, чтобы его зеркальная плоскость была под углом 45 градусов к лучу. Затем поместите зеркало три 100 миллиметров от зеркала два, и выровнять его так, что это зеркало плоскости находится под углом 45 градусов к лучу отражается от зеркала два. Используйте этот отраженный луч, чтобы сформировать одну сторону двойного светового листа освещения.
На обратной стороне пучка сплиттера, поместите зеркало пять так, что это зеркальная плоскость находится на 45 градусов к лучу, который излучается в направлении вперед. Используйте луч, испускаемый из зеркала пять, чтобы сформировать вторую сторону двойного светового листа освещения. Далее, настроить двустороннюю систему освещения в системной форме.
Поместите цилиндрический объектив на 2 150 миллиметров от зеркала три, и еще один идентичный цилиндрический объектив 150 миллиметров от зеркала пять, на другой стороне двойной установки освещения. Затем поместите два зеркала, каждое в соответствии с цилиндрическими линзами, на расстоянии 50 миллиметров, чтобы отразить луч при 90 градусах. По обе стороны светового листа образуют ахроматический дублет из пары линз, при этом первый объектив помещается на 100 миллиметров от предыдущего зеркала и имеет диаметр одного дюйма и фокусную длину 100 миллиметров.
Второй объектив должен быть помещен 160 миллиметров от объектива один, с диаметром одного дюйма, и фокусной длиной 60 миллиметров. Затем поместите цели освещения на один и два 150 миллиметров от предыдущих ахроматических дублетов, чтобы они были в соответствии с лучом. Луч, испускаемый в результате целей, образует световой лист для визуализации образцов.
Во-первых, подготовить флуоресцентный образец шарика, разбавляя 0,53 микрометра шариковый раствор, от одного до 150000, в предварительно разогретом рефракционном растворе соответствия индекса, с одним процентом низкого расплава указывая агарозу. Затем используйте кусок борозиликатной стеклянной трубки с внутренним диаметром 12 миллиметров и внешним диаметром 18 миллиметров длиной 30 миллиметров. Pipette бисера агарозы раствор в борозиликатных труб и позволяют агарозы затвердеть при комнатной температуре.
Теперь заполните 3-D печатной abs камеры с 99,5 процента gylcerol решение. Поместите боросиликатные стеклянные трубки, содержащие бисер, внутри камеры. Прикрепите 3-D моторизованный этап перевода к борозиликатной стеклянной трубе для контроля движения и ориентации образца в камере ABS.
Затем используйте специально разработанное программное обеспечение для получения изображений с помощью камеры sCMOS со скоростью 30 кадров в секунду. Используя контроллер двигателя, перемести образец на один миллиметр в боковом направлении и приобретайте изображения с шагом в один миллиметр, пока весь образец не будет изображен. Стек приобретенных изображений с помощью программного обеспечения визуализации, и измерить функцию распространения точки системы с помощью этих изображений шарика.
Используйте рефракционный индекс соответствия решение, с рН 7,5, и растворить один процент агарозы в соответствующий раствор. Поместите очищенную образец сердца взрослой мыши в рефракционный раствор соответствия индекса, с растворенным одним процентом агарозы. Затем вставьте образец в борозиликатные стеклянные трубки и дайте агарозе затвердеть при комнатной температуре.
Прикрепите 3-D моторизованный этап перевода к борозиликатной стеклянной трубе, чтобы контролировать движение и ориентацию образца в 3-D печатной камере ABS. Распоимите образец так, чтобы он был в центре гауссийского луча, созданного двойной системой освещения. Затем установите скорость приобретения камеры sCMOS до 30 кадров в секунду.
Теперь, используя контроллер двигателя, перемести образец на один миллиметр в направлении ося и получить изображения на каждом миллиметре шагом. Продолжайте до тех пор, пока весь образец не будет изображен. Стек приобретенных изображений с помощью программного обеспечения визуализации.
Разработайте 3-D изображения с помощью этих стеков изображений. Для достижения этой цели деконвольировать функцию распространения тока, определяемую ранее, и использовать ее для приобретенных стеков изображений. Наконец, установите значение интенсивности порога пикселей, чтобы наблюдать контуры сердца, и добавьте псевдоцвет к изображениям, основываясь на этой интенсивности серого масштаба.
В первый день послеродовой, можно визуализировать клапаны, атриум, желудочек, пектинат мышцы, и трабекуляции, среди других особенностей. В седьмой день послеродового, функции еще более определены. Атриум, желудочек, желудочковые размеры полости, и толщина стенки желудочка все очевидны.
Для изучения кардиомиоцитов дифференциации в сердце, гетерозиготные стук в мышей были cre-помечены, чтобы показать кардиомиоцитов. Помеченные ячейки показаны здесь, в каждом направлении плоскости. Три плоскости были объединены, чтобы создать трехмерную визуализацию сердца.
Красный кружил области в вставке показывает два полупрозрачных сердца мыши после прохождения техники ясности и вставляется в borosilicate стеклянные трубки. В дополнение к изучению послеродовых мышей, система визуализации также может быть использована для изучения сердца взрослой мыши. Здесь GFP помечены ROMK каналы отображаются на 7,5 месяцев.
Они были в основном найдены в желудочковой стенке. После освоения, эта техника может быть сделано в одну-две минуты. При попытке этой процедуры, важно удалить все пузырьки вокруг образца в трубке.
Другие методы, такие как автоматическая сегментация стеков изображений, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные с сердечно-сосудистыми травмами и регенерацией. После своего развития, этот метод был использован исследователями для изучения сердечной архитектуры в послеродовой и взрослой стадии развития у мышей.
