Il vantaggio principale di questa tecnologia è che consente una rapida imaging del cuore del mouse. E può essere usato per osservare la presenza di canali d'aria dopo la terapia genica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla cardiologia dello sviluppo, può anche essere applicato ad altri sistemi, come la neurologia e la pneumologia.
Generalmente, gli individui avranno difficoltà con questa tecnica perché montare un'immagine del cuore del topo adulto può essere difficile, ed è diverso da altre tecniche tradizionali, come la microscopia confocale e invertita. Posizionare un laser ad onda continua con tre lunghezze d'onda di 405 nanometri, 473 nanometri e 532 nanometri. Quindi, apporre uno specchio e allinearlo con il piano dello specchio a 45 gradi al fascio.
Questo dirigerà il laser verso lo splitter del fascio, che forma la configurazione dell'illuminazione a due lati. Quindi, passare il fascio attraverso un filtro di densità neutra di 50 millimetri di diametro, un espansore di travi e un foro perno di 25 millimetri di diametro, tutti posizionati a 150 millimetri l'uno dall'altro. Passare la trave attraverso uno splitter a fascio 50-50, posizionato a 150 millimetri dal foro stenopeico.
Quindi, posizionare lo specchio a due 150 millimetri dallo splitter del fascio, a 90 gradi al fascio in avanti, e allinearlo in modo che il suo piano specchio sia ad un angolo di 45 gradi rispetto al fascio. Quindi, posizionare lo specchio a tre 100 millimetri dallo specchio due, e allinearlo in modo che il suo piano speculare sia ad un angolo di 45 gradi rispetto al fascio riflesso dallo specchio due. Utilizzare questo fascio riflesso per formare un lato della scheda luminosa a doppia illuminazione.
Sul lato opposto dello splitter del fascio, posizionare lo specchio cinque in modo che il suo piano speculare sia a 45 gradi dal fascio emesso in avanti. Utilizzare il fascio emesso dallo specchio cinque per formare il secondo lato della doppia scheda luminosa di illuminazione. Successivamente, impostare il sistema di illuminazione a doppia aspetto in modo sistemico.
Posizionare l'obiettivo cilindrico a due 150 millimetri di distanza dallo specchio tre e un'altra lente cilindrica identica a 150 millimetri di distanza dallo specchio cinque, dall'altra parte della configurazione a doppia illuminazione. Quindi, posizionare due specchi, ciascuno in linea con le lenti cilindriche, a distanze di 50 millimetri per riflettere il fascio a 90 gradi. Su entrambi i lati del foglio luminoso, formare un farsettino acromatico da un paio di lenti, con la prima lente posizionata a 100 millimetri dallo specchio precedente e con un diametro di un pollice e una lunghezza focale di 100 millimetri.
La seconda lente deve essere posizionata a 160 millimetri dall'obiettivo uno, con un diametro di un pollice e una lunghezza focale di 60 millimetri. Quindi, posizionare gli obiettivi di illuminazione uno e due 150 millimetri dai precedenti doppietti acromatici, in modo che siano in linea con il fascio. Il fascio emesso dagli obiettivi forma la scheda luminosa per l'imaging dei campioni.
In primo luogo, preparare il campione di perline fluorescenti diluendo una soluzione di perline da 0,53 micrometri, da uno a 150.000, in una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione pre-riscaldata, con un'agarose di puntamento a bassa fusione dell'uno per cento. Successivamente, utilizzare un pezzo di tubi di vetro borosilicato con un diametro interno di 12 millimetri e un diametro esterno di 18 millimetri, per una lunghezza di 30 millimetri. Pipettare la soluzione di agarosio di perline nei tubi borosilicati e lasciare che l'agarosio si solidifichi a temperatura ambiente.
Ora, riempire una camera abs stampata in 3D con una soluzione di gylcerolo al 99,5%. Posizionare i tubi di vetro borosilicate, contenenti le perline, all'interno della camera. Attaccare uno stadio traslazionale motorizzato 3D ai tubi di vetro borosilicato per controllare il movimento e l'orientamento del campione all'interno della camera ABS.
Quindi, utilizza un software progettato su misura per acquisire immagini utilizzando la fotocamera sCMOS, a una velocità di 30 fotogrammi al secondo. Utilizzando il controller del motore, spostare il campione di un millimetro nella direzione laterale e acquisire immagini con ogni incremento di un millimetro, fino a quando l'intero campione non è stato immaginato. Impilare le immagini acquisite utilizzando un software di visualizzazione e misurare la funzione di diffusione del punto del sistema utilizzando queste immagini di perline.
Utilizzare una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione, con un pH di 7,5, e sciogliere l'uno per cento di agarosio nella soluzione corrispondente. Posizionare un campione di cuore di topo adulto cancellato nella soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione, con l'uno per cento di agarosio sciolto. Quindi, inserire il campione in tubi di vetro borosilicato e lasciare che l'agarosio si solidifichi a temperatura ambiente.
Attaccare uno stadio traslazionale motorizzato 3D al tubo di vetro borosilicato per controllare il movimento e l'orientamento del campione all'interno di una camera ABS stampata in 3D. Posizionare il campione in modo che si trova al centro del fascio gaussiano, creato dal sistema di doppia illuminazione. Quindi, impostare la velocità di acquisizione della fotocamera sCMOS su 30 fotogrammi al secondo.
Ora, usando il controller del motore, spostare il campione di un millimetro nella direzione assiale e acquisire immagini ad ogni incremento di un millimetro. Continuare fino a quando l'intero campione non è stato immaginato. Impilare le immagini acquisite utilizzando un software di visualizzazione.
Sviluppa le immagini 3D usando questi stack di immagini. A tale scopo, deconvolgere la funzione di diffusione del punto determinata in precedenza e utilizzarla per gli stack di immagini acquisiti. Infine, impostate un valore di intensità della soglia di pixel per osservare i contorni del cuore e aggiungete pseudocolore alle immagini, in base a questa intensità in scala di grigi.
Al primo giorno post-natale, si possono visualizzare le valvole, l'atrio, il ventricolo, il muscolo pectinato e la trabeculazione, tra le altre caratteristiche. Al settimo giorno post-natale, le caratteristiche sono ancora più definite. L'atrio, il ventricolo, le dimensioni della cavità ventricolare e lo spessore della parete ventricolare sono tutti evidenti.
Per studiare la differenziazione dei cardiomiociti all'interno del cuore, i topi knock-in eterozigoti sono stati etichettati per mostrare cardiomiociti. Le celle etichettate sono mostrate qui, in ogni direzione del piano. I tre piani furono uniti, per creare un rendering 3D del cuore.
La regione cerchiata rossa all'interno dell'inserto mostra due cuori di topo traslucidi dopo aver subito la tecnica della chiarezza e essere stati inseriti nei tubi di vetro borosilicati. Oltre a studiare i topi post-natali, il sistema di imaging può anche essere utilizzato per studiare il cuore adulto del topo. Qui, i canali ROMK taggati GFP sono mostrati a 7,5 mesi.
Questi sono stati trovati principalmente nella parete ventricolare. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in uno o due minuti. Quando si tenta questa procedura, è importante rimuovere tutte le bolle intorno al campione nel tubo.
Altri metodi, come l'auto-segmentazione degli stack di immagini, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive relative alle lesioni cardiovascolari e alla rigenerazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica è stata utilizzata dai ricercatori per studiare l'architettura cardiaca nelle fasi di sviluppo post-natale e adulto nei topi.
