이 기술의 주요 장점은 마우스 심장 중 하나의 빠른 이미징을 허용한다는 것입니다. 그리고 유전자 치료 후 공기 채널의 존재를 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 발달 심장학에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만 신경학 및 폐학과 같은 다른 시스템에도 적용 될 수 있습니다.
일반적으로, 개별은 성인 마우스 심혼의 화상 진찰을 장착하는 것은 어려울 수 있고, 공초점 및 반전된 현미경 검사법과 같은 그밖, 전통적인 기술에서 다르기 때문에 이 기술로 투쟁할 것입니다. 405 나노미터, 473 나노미터 및 532 나노미터의 3 개의 파장을 가진 연속 파레이저를 배치합니다. 그런 다음 미러를 부착하고 45도에서 거울 평면과 빔에 정렬합니다.
이렇게 하면 레이저가 빔 스플리터쪽으로 향하게 되며, 이는 양면 조명 설정을 형성합니다. 다음으로, 50mm 직경의 중성 밀도 필터, 빔 익스팬더 및 25mm 직경핀 구멍을 통해 빔을 전달하며, 모두 서로 150mm 떨어진 곳에 배치됩니다. 핀홀에서 150밀리미터 떨어진 50-50 빔 스플리터를 통과합니다.
다음으로 빔 스플리터에서 150mm 떨어진 미러 2개를 90도에서 전방 빔으로 배치하고 미러 평면이 빔에 45도 각도로 되도록 정렬합니다. 그런 다음 미러 2에서 미러 3 개를 100밀리미터 3개 배치하고 미러 평면이 미러 2에서 반사되는 빔에 45도 각도로 되도록 정렬합니다. 이 반사 빔을 사용하여 이중 조명 라이트 시트의 한쪽을 형성합니다.
빔 스플리터의 맨 쪽에 미러 5를 배치하여 미러 평면이 전방 방향으로 방출되는 빔에 45도 떨어져 있습니다. 미러 5에서 방출되는 빔을 사용하여 이중 조명 광시트의 두 번째 면을 형성합니다. 다음으로, 체계적인 방식으로 이중 측 조명 시스템을 설정합니다.
원통형 렌즈2대150밀리미터 에서 미러 3, 또 다른 동일한 원통형 렌즈를 거울 5에서 150밀리미터 떨어진 곳에 두면 이중 조명 설정의 반대편에 놓습니다. 다음으로, 각각 원통형 렌즈에 맞춰 각각 2개의 거울을 50mm 의 거리에 배치하여 빔을 90도반사합니다. 라이트 시트의 양쪽에, 렌즈 의 쌍에서 achromatic 더블을 형성, 첫 번째 렌즈는 이전 거울에서 100 밀리미터 배치되고, 1 인치 직경과 100 밀리미터의 초점 길이를 갖는.
두 번째 렌즈는 렌즈 1개에서 160mm, 직경은 1인치, 초점 거리는 60mm로 배치되어야 합니다. 그런 다음, 조명 목표를 이전 achromatic doublets에서 150밀리미터, 그래서 빔과 일치되도록 배치합니다. 목표에서 방출되는 빔은 샘플을 이미징하기 위한 광시트를 형성합니다.
먼저, 0.53 마이크로미터 비드 용액을 1~150, 000으로 미리 데워진 굴절률 매칭 솔루션에 희석하여 형광 비드 샘플을 준비하고, 1% 낮은 용융을 가리키는 아가로즈를 사용한다. 다음으로, 12밀리미터의 내지름과 외경 18mm의 보로실리케이트 유리 튜브를 길이 30mm로 사용합니다. 보로실리케이트 튜브의 비드 아가로즈 용액파이펫을 피펫하여 실온에서 아가로즈가 고화되도록 합니다.
지금, 99.5 % gylcerol 솔루션으로 3 D 인쇄 ABS 챔버를 채우기. 구슬이 들어 있는 보로실리케이트 유리 튜브를 챔버 내부에 놓습니다. ABS 챔버 내의 시료의 움직임과 방향을 제어하기 위해 3D 전동 번역 단계를 borosilicate 유리 튜브에 부착합니다.
그런 다음 사용자 지정 설계 소프트웨어를 사용하여 초당 30 프레임의 속도로 sCMOS 카메라를 사용하여 이미지를 수집합니다. 모터 컨트롤러를 사용하여 샘플을 측면 방향으로 1밀리미터 이동하고 전체 샘플이 이미지화될 때까지 각 1밀리미터 단위로 이미지를 수집합니다. 시각화 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지를 스택하고 이러한 비드 이미지를 사용하여 시스템의 포인트 확산 기능을 측정합니다.
7.5의 pH와 굴절 인덱스 일치 솔루션을 사용하고 1%의 아가로즈를 일치 솔루션에 용해합니다. 클리어된 성인 마우스 심장 샘플을 굴절지수 매칭 솔루션에 넣고 1%의 아가로즈가 용해됩니다. 그런 다음, 샘플을 보로실리케이트 유리 튜브에 삽입하고, 아가로즈가 실온에서 고화되도록 한다.
3D 프린팅 ABS 챔버 내에서 샘플의 움직임과 방향을 제어하기 위해 3D 전동 번역 단계를 보로실리케이트 유리 튜브에 부착합니다. 이중 조명 시스템에 의해 생성된 가우시안 빔의 중심에 있도록 샘플을 배치합니다. 그런 다음 sCMOS 카메라의 획득 속도를 초당 30프레임으로 설정합니다.
이제 모터 컨트롤러를 사용하여 샘플을 축 방향으로 1밀리미터 이동하고 각 1밀리미터 단위로 이미지를 수집합니다. 전체 샘플이 이미지화될 때까지 계속합니다. 시각화 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지를 스택합니다.
이러한 이미지 스택을 사용하여 3D 이미지를 개발합니다. 이를 위해 이전에 결정된 포인트 스프레드 함수를 데온볼브하고 획득한 이미지 스택에 활용합니다. 마지막으로 픽셀 임계값 을 설정하여 심장의 윤곽을 관찰하고 이 회색 배율 강도를 기반으로 이미지에 의사 색상을 추가합니다.
어느 날 산후, 하나는 밸브, 아트리움, 심실, 페티나테 근육 및 궤적을 시각화 할 수 있습니다. 산후 7일째에 그 특징은 더욱 정의됩니다. 심실, 심실 구멍 치수 및 심실 벽 두께는 모두 분명합니다.
심장 내의 심근세포 분화를 연구하기 위해 이종구스 노크인 마우스는 심근세포를 보여주기 위해 크레라벨을 부착했습니다. 표지된 셀은 각 평면 방향으로 여기에 표시됩니다. 세 개의 평면이 병합되어 심장의 3D 렌더링을 만들었습니다.
인셋 내의 빨간색 원영역은 선명도 기술을 받고 보로실리케이트 유리 튜브에 삽입된 후 두 개의 반투명 마우스 하트를 보여줍니다. 산후 마우스를 공부하는 것 외에도, 이미징 시스템은 성인 마우스 심장을 연구하는 데사용할 수도 있습니다. 여기서, GFP 태그 ROMK 채널은 7.5 개월에 표시됩니다.
이들은 주로 심실 벽에서 찾아냈습니다. 이 기술을 마스터하면 1~2분 후에 이 기술을 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 튜브의 샘플 주위의 모든 거품을 제거하는 것이 중요합니다.
이미지 스택의 자동 세분화와 같은 다른 방법은 심혈관 손상 및 재생과 관련된 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다. 그것의 발달 후에, 이 기술은 마우스에 있는 산후 및 성인 발달 단계에 있는 심장 건축을 공부하기 위하여 연구원에 의해 이용되었습니다.
