この方法は、スイカボトルひもグラフトの冷たいストレス下でmiRNAがどのように調節されているかなど、植物移植片のストレス能力に対するmiRNA応答の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点はホモおよびヘテロ移植片を作るために非常に能率的で再生可能な方法である。それは特定の装置を必要としない、それは非常に行い易く、そして典型的には移植の非常に高い生存率をもたらす。
この方法により、スイカボトルひんごグラフト系における冷たいストレスに対するmiRNA応答に関する洞察を提供できる。また、ローカルおよび長距離miRNA輸送のメカニズムを明らかにするために、他の現代の生物にも適用することができます。移植ステップは学習が困難であるため、この方法の視覚的実証は重要である。
このステップは、高度なスキルを必要とし、移植された植物の生存の鍵です。まず、ボトルのうまくもの種を摂氏58度の500ミリリットルのビーカーに浸します。水温が摂氏40度になるまで、時折種をかき混ぜます。
水が冷える間、3キロの泥炭の土壌をナイロンバッグに入れ、オートクレーブします。水が室温に達したら、種子を蒸留水で2〜3回洗い流し、余分な水を排出します。種子が暗い成長室で摂氏28度でガーゼ袋に芽を出すことを許可します。
発芽後、種子を殺菌された泥炭土壌で満たされたプラスチックポットにまきます。ボトルヒール苗が2つの平らなコチルドンを開発したら、スイカの種でこのプロセスを繰り返します。成長室でボトルのヒリガメとスイカの苗を成長させます。
午後に1日1回苗に水を加えます。次に、スイカの苗の低コチルをコチルレドンの下に2〜3センチメートル切ります。ボトルのヒールヒ足の苗の上を、コチルドンのすぐ上に切ります。
その後、爪楊枝を使用して、トリミングされたボトルヒョルヒの苗の上部に穴を開けます。トリミングしたスイカの苗を穴に入れ、ヘテロ移植片を作ります。この後、先に述べた方法を用いて同種移植片を調製する。
まず、移植した苗を透明なポリエチレン袋に包み、比較的高い湿度を維持します。その後、7日間の成長室で包まれた苗を維持します。7日目以降、袋を取り出し、7~10日間同じ条件で植物を育てるようにします。
苗を2つのグループに分け、1つは冷たい処理用、もう1つはコントロール用です。制御苗を同じ環境条件に戻します。冷たい処理された苗を、対照群と同じ明るい暗い条件で摂氏6度に設定された成長室に入れます。
48時間後、サイオンと根株のサンプルを移植片から残します。サンプルを液体窒素で直ちに凍結し、マイナス70度で保管してください。冷凍サンプルを液体窒素中の2ミリリットルマイクロ遠心分離管に移します。
各サンプルチューブにステンレスビーズを加え、組織を細かい粉末に均質化します。各接木の組み合わせについて、10個の苗から等量の挽いたサンプルを採取し、10ミリリットルの遠心分離管に混ぜます。適量のグアニジウム塩酸試薬を加える。
次に、RNAフリーDNaseを1〜150単位で37°Cで1時間加えます。次に、マイクロキャピラリー電気泳動システム上のRNAの総量を求めます。この後、ライブラリの正規化試薬およびアダプタを解凍します。
その後、5つの素数と3つのプライムアダプタで小さなRNaseをリゲートし、それらを溶出して浄化します。メーカーのガイドラインに従って、5つの素数と3つのプライムリゲーテッド小さなRNaseを逆に書き起こします。次に、メーカーのプロトコルに従ってPCR増幅を行います。
次に、マイクロカイラリー電気泳動システムを使用して、RNAの完全性の数が7より大きいことを確認します。RNAの完全性の数が7より大きいことを保障するためにマイクロキャピラリー電気泳動システムのRNAライブラリーの1マイクロリットルをロードする。最後に、小さなRNAライブラリをハイスループットシーケンシング装置で配列します。
このプロトコルを用いて、移植のための98%の生存率と室温および低温ストレス条件のためのフェノタイプが得られた。24ヌクレオチドのsRNAは、温度処理に関係なく、すべての移植結合のsRNAの最大のクラスを構成した。48時間の冷たい治療の後、30および268マイクロRNAはそれぞれ上下調節された。
ヘテロ移植片におけるサイオンの葉では、逆に、根株の葉では、31および12マイクロRNAがそれぞれ上下調節された。スイカとスイカの同種移植片では、64および83マイクロRNAがそれぞれ上下調節されていた。これは、異種移植がマイクロRNA表現の深い再プログラミングを引き起こしたことを示した。
この手順を試みる間、娘の茎の相対的な大きさと年齢を覚えておくことが重要であり、サイオンは正常な移植片を作るために重要です。この手順に従って、lncRNAシーケンシングのような他の方法、移植系におけるlncRNAおよびタンパク質およびコード系の調節を調査するためにプロテオームプロファイリングを行うことができる。その開発後、この技術は、Cucurbitaceaeおよびそれ以降の植物移植の利点のメカニズムを探求するために植物の不生物耐性の分野での研究のための道を開いた。
グアニジン塩酸塩での作業は非常に危険であり、適切な予防措置は、常にこの手順を実行して取られる必要があることを忘れないでください.
