Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na resposta do miRNA à capacidade de estressar em enxertos vegetais, como como o miRNA é regulado sob estresse frio em enxertos de cabaça de garrafa de melancia. A principal vantagem dessa técnica é que é um método altamente eficiente e reprodutível para fazer homo e heteroenxertos. Não requer nenhum equipamento específico, é muito fácil de executar, e normalmente resulta em uma taxa de sobrevivência muito alta de enxerto.
Através deste método, pode fornecer insights sobre a resposta do miRNA ao estresse frio no sistema de enxerto de cabaça de garrafa de melancia. Também pode ser aplicado a outros organismos modernos para revelar os mecanismos do transporte miRNA local e de longa distância. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos de enxerto são difíceis de aprender.
Esta etapa exigiu habilidades avançadas e são fundamentais para a sobrevivência das plantas enxertadas. Para começar, mergulhe as sementes de cabaça de garrafa em um béquer de 500 mililitros de 58 graus Celsius de água. Mexa as sementes ocasionalmente até que a temperatura da água caia para 40 graus Celsius.
Enquanto a água esfria, coloque três quilos de solo de turfa em um saco de nylon e autoclave-o. Uma vez que a água atinja a temperatura ambiente, enxágue as sementes duas a três vezes em água destilada e drene o excesso de água. Deixe as sementes brotarem em um saco de gaze a 28 graus Celsius na câmara de crescimento escuro.
Após a germinação, semeie as sementes em potes plásticos cheios de solo de turfa esterilizado. Quando as mudas de abóbora de garrafa desenvolverem dois cotilledons achatados, repita este processo com sementes de melancia. Cultivar a cabaça de garrafa e as mudas de melancia em uma câmara de crescimento.
Adicione água às mudas uma vez por dia à tarde. Em seguida, corte os hipocotyls das mudas de melancia de dois a três centímetros abaixo dos cotilos. Corte a parte superior das mudas de cabaça da garrafa ao lado, imediatamente acima dos cotilledons.
Em seguida, use um palito para fazer um buraco no topo das mudas de cabaça de garrafa aparadas. Insira as mudas de melancia aparadas no orifício para fazer heteroenxertos. Depois disso, prepare os homoenerxes usando o método descrito anteriormente.
Primeiro, enrole as mudas enxertadas em sacos transparentes de polietileno para manter uma umidade relativamente alta. Em seguida, mantenha as mudas embrulhadas em uma câmara de crescimento por sete dias. Após o sétimo dia, retire os sacos e permita que as plantas cresçam sob as mesmas condições por sete a dez dias.
Divida as mudas em dois grupos, um para tratamentos frios e outro para controle. Devolva as mudas de controle para as mesmas condições ambientais. Coloque as mudas tratadas a frio em uma câmara de crescimento fixada em seis graus Celsius com as mesmas condições escuras claras do grupo controle.
Após 48 horas, deixe as amostras do descendente e das raízes dos enxertos. Congele as amostras imediatamente em nitrogênio líquido e armazene-as a menos 70 graus Celsius. Transfira a amostra congelada para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros em nitrogênio líquido.
Adicione uma conta de aço inoxidável a cada tubo de amostra e homogeneize os tecidos em um pó fino. Para cada combinação de enxerto, pegue quantidades iguais de amostra de terra de 10 mudas e misture-as em um tubo de centrífuga de 10 mililitros. Adicione uma quantidade apropriada de reagente de cloridrato de guanidium.
Em seguida, adicione DNase sem RNA de um a 150 unidades por mililitro a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, determine a quantidade total de RNA em um sistema de eletroforese microcapilal. Depois disso, descongele os reagentes e adaptadores de normalização da biblioteca.
Em seguida, ligate pequeno RNase com os cinco principais e três adaptadores prime, e elute e purificá-los. Transcreva invertida o RNase pequeno de cinco primes e três prime ligado seguindo as diretrizes do fabricante. Em seguida, execute a amplificação do PCR seguindo o protocolo do fabricante.
Em seguida, use o sistema de eletroforese microcaillary para garantir que o número de integridade do RNA seja maior que sete. Carregue um microliter de uma biblioteca de RNA no sistema de eletroforese microcapilal para garantir que o número de integridade do RNA seja maior que sete. Finalmente, sequencie as pequenas bibliotecas de RNA em um instrumento de sequenciamento de alto rendimento.
Por meio deste protocolo, obteve-se uma taxa de sobrevivência de 98% para enxerto e os fenótipos para temperatura ambiente e condições de estresse frio. sRNAs de 24 nucleotídeos compõem a maior classe de sRNAs em todas as combinações de enxerto, independentemente do tratamento de temperatura. Após 48 horas de tratamento frio, 30 e 268 microRNAs foram reguladas para cima e para baixo, respectivamente.
Nas folhas do descendente em heteroenxertos, inversamente, nas folhas do rootstock, 31 e 12 microRNAs foram para cima e para baixo regulados, respectivamente. Nos homoenerxertos de melancia-melancia, 64 e 83 microRNAs foram regulados para cima e para baixo, respectivamente. Isso demonstrou que o heteroenxerto causou uma reprogramação profunda das expressões do microRNA.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar o tamanho relativo e a idade do talo da filha e o descendente é fundamental para fazer um enxerto bem sucedido. Após esse procedimento, outros métodos como o sequenciamento do LNCRNA, o perfil proteômico podem ser realizados a fim de investigar a regulação do LNCRNA e da proteína e do sistema de codificação no sistema de enxerto. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para a pesquisa no campo da tolerância abiótica vegetal para explorar o mecanismo de vantagem de enxerto vegetal em Cucurbitaceae e além.
Não se esqueça que trabalhar com cloridrato de guanidina pode ser extremamente perigoso e a precaução apropriada deve ser sempre tomada com a realização deste procedimento.
