Bu yöntem, miRNA'nın karpuz şişesi kagrgreftlerinde soğuk stres altında nasıl düzenlendiği gibi bitki greftlerinde stres yeteneğine miRNA yanıtındaki anahtar soruların yanıtlaşmasında yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı homo ve heterogreft yapmak için son derece verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem olmasıdır. Bu özel bir ekipman gerektirir, gerçekleştirmek için çok kolaydır, ve genellikle aşılama çok yüksek bir sağkalım oranı ile sonuçlanır.
Bu yöntem sayesinde, karpuz şişesi kagr greft sisteminde soğuk strese miRNA yanıtı içine fikir sağlayabilir. Ayrıca yerel ve uzun mesafe miRNA ulaşım mekanizmaları ortaya çıkarmak için diğer modern organizmalara uygulanabilir. Aşılama adımlarını öğrenmek zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.
Bu adım gelişmiş beceriler gerekli ve aşılı bitkilerin hayatta kalma anahtarıdır. Başlamak için, 58 santigrat derece su 500 mililitrelik bir kabın şişe kaınır tohumları ıslatın. Su sıcaklığı 40 santigrat dereceye düşene kadar zaman zaman tohumları karıştırın.
Su soğurken, bir naylon torbaya üç kilo turba toprağı koyun ve otoklavlayın. Su oda sıcaklığına ulaştığında, tohumları damıtılmış suda 2-3 kez durulayın ve fazla suyu boşaltın. Tohumların karanlık büyüme odasında 28 santigrat derecede gazlı bez torbasında filizlenmelerine izin verin.
Çimlenme sonra, sterilize turba toprak ile dolu plastik tencere içine tohumları ekin. Şişe kamış fidesi iki basık cotyledon geliştirdiğinde, bu işlemi karpuz tohumu ile tekrarlayın. Bir büyüme odasında şişe kaını ve karpuz fideleri büyütün.
Öğleden sonra günde bir kez fidelere su ekleyin. Sonra, karpuz fidelerinin hipokotillerini cotyledonların 2-3 santimetre altında kesin. Yan şişe gourd fide üst kesin, hemen cotyledons yukarıda.
Sonra kesilmiş şişe gourd fide üst bir delik yapmak için bir kürdan kullanın. Heterogreftler yapmak için deliğe kesilmiş karpuz fideleri yerleştirin. Bundan sonra, homogreftleri daha önce açıklanan yöntemi kullanarak hazırlayın.
İlk olarak, nispeten yüksek nem korumak için şeffaf polietilen torbalar aşılanmış fideler sarın. Sonra yedi gün boyunca bir büyüme odasında sarılmış fideler korumak. Yedinci günden sonra, çanta kaldırmak ve bitkiler yedi ila 10 gün boyunca aynı koşullar altında büyümeye izin.
Fideleri biri soğuk tedaviler, diğeri kontrol için olmak üzere iki gruba ayırın. Kontrol fidelerini aynı çevre koşullarına geri döndürün. Kontrol grubu ile aynı açık karanlık koşullarda altı derece santigrat ayarlanmış bir büyüme odasına soğuk işlenmiş fide yerleştirin.
48 saat sonra, greftlerden scion ve anaç örnekleri bırakın. Numuneleri hemen sıvı nitrojenle dondurun ve eksi 70 derecede saklayın. Dondurulmuş numuneyi sıvı nitrojen içinde iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Her numune tüpüne paslanmaz çelik boncuk ekleyin ve dokuları ince bir tozla homojenize edin. Her aşılama kombinasyonu için, 10 fideden eşit miktarda zemin numunesi alın ve bunları 10 mililitrelik bir santrifüj tüpünde karıştırın. Guanidium hidroklorür reaktifuygun miktarda ekleyin.
Daha sonra, bir saat boyunca 37 santigrat derecede mililitre başına 1 ila 150 adet RNA içermeyen DNase ekleyin. Daha sonra mikrokapiller elektroforez sistemindeki toplam RNA miktarını belirleyin. Bundan sonra, kitaplık normalleştirme reaktifleri ve bağdaştırıcıları çözültün.
Sonra beş asal ve üç asal adaptörleri ile küçük RNase ligate ve onları elute ve arındırmak. Üreticinin yönergelerine uygun olarak beş asal ve üç prime ligated küçük RNase ters transkripsiyonu. Ardından, üreticinin protokolünü izleyerek PCR amplifikasyonu gerçekleştirin.
Daha sonra RNA bütünlük numarasının yediden büyük olduğundan emin olmak için mikrocaillary elektroforez sistemini kullanın. RNA bütünlük sayısının yediden büyük olmasını sağlamak için bir RNA kütüphanesinin bir mikrolitresini mikrokapiller elektroforez sistemine yükleyin. Son olarak, küçük RNA kitaplıklarını yüksek bir iş elde sıralama aleti üzerinde sıralayın.
Bu protokol kullanılarak aşılama için %98 sağkalım oranı ve oda sıcaklığı ve soğuk stres koşulları için fenotipler elde edilmiştir. 24 nükleotitin sRNA'ları, sıcaklık tedavisine bakılmaksızın tüm greftleme kombinasyonlarında en büyük sRNA sınıfını oluşturur. 48 saatlik soğuk tedaviden sonra sırasıyla 30 ve 268 mikroRNA yukarı ve aşağı düzenlenmiştir.
Heterogreftlerde scion yapraklarında, tersine, anaç yapraklarında, 31 ve 12 mikroRNA'lar sırasıyla yukarı ve aşağı düzenlenirdi. Karpuz-karpuz homogreftlerinde sırasıyla 64 ve 83 mikroRNA'lar yukarı ve aşağı düzenlenmiştir. Bu, heterogreftlemenin mikroRNA ekspresyonlarının derin bir şekilde yeniden programlanmasına neden olduğunu göstermiştir.
Bu işlemi denerken, kız sapının göreceli boyutunu ve yaşını hatırlamak önemlidir ve scion başarılı bir greft yapmak için çok önemlidir. Bu işlemden sonra lncRNA dizilimi, proteomik profilleme gibi diğer yöntemler de lncRNA ve proteinin düzenlenmesive aşılama sistemindeki kodlama sisteminin araştırılması için yapılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik Cucurbitaceae ve ötesinde bitki aşılama avantajı mekanizmasını keşfetmek için bitki abiyotik tolerans alanında araştırma için yol açtı.
Guanidin hidroklorür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemin gerçekleştirilmesi nde her zaman uygun önlem alınması gerektiğini unutmayın.
