Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in miRNA Antwort auf die Fähigkeit zu stressen in Pflanzentransplantate wie wie miRNA unter Kältestress in WassermelonenFlaschen-Gourd-Transplantate reguliert werden zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es hocheffiziente und reproduzierbare Methode ist, Homo und Heterotransplantate herzustellen. Es erfordert keine spezifische Ausrüstung, es ist sehr einfach durchzuführen, und führt in der Regel zu einer sehr hohen Überlebensrate der Transplantation.
Durch diese Methode, kann Einblick in miRNA Reaktion auf Kältestress in der Wassermelone Flasche Gourd Transplantatsystem geben. Es kann auch auf andere moderne Organismen angewendet werden, um die Mechanismen des lokalen und Fern-miRNA-Transports zu enthüllen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Pfropfschritte schwer zu erlernen sind.
Dieser Schritt erforderte fortgeschrittene Fähigkeiten und ist der Schlüssel zum Überleben der transplantierten Pflanzen. Zunächst können Sie in einem 500-Milliliter-Becher mit 58 Grad Celsius Wasser die Flaschenkräutersamen einweichen. Rühren Sie die Samen gelegentlich, bis die Wassertemperatur auf 40 Grad Celsius sinkt.
Während das Wasser abkühlt, drei Kilogramm Torfboden in eine Nylontasche geben und autoklavieren. Sobald das Wasser Raumtemperatur erreicht hat, spülen Sie die Samen zwei- bis dreimal in destilliertem Wasser ab und entleeren Sie das überschüssige Wasser. Lassen Sie die Samen in einem Gazebeutel bei 28 Grad Celsius in der dunklen Wachstumskammer sprießen.
Nach der Keimung die Samen in Plastiktöpfe säen, die mit dem sterilisierten Torfboden gefüllt sind. Wenn die Flaschenkräutersämlinge zwei abgeflachte Cotyledons entwickeln, wiederholen Sie diesen Prozess mit Wassermelonensamen. Die Flaschenbekörnung und die Wassermelonensämlinge in einer Wachstumskammer anbauen.
Fügen Sie den Sämlingen einmal täglich am Nachmittag Wasser hinzu. Als nächstes schneiden Sie die Hypocotyle der Wassermelonensämlinge zwei bis drei Zentimeter unter die Kotyledonen. Schneiden Sie die Oberseite der Flasche Besteck Sämlinge an der Seite, direkt über den Cotyledons.
Dann verwenden Sie einen Zahnstocher, um ein Loch in der Oberseite der getrimmten Flasche Besatz Sämlinge zu machen. Legen Sie die getrimmten Wassermelonensämlinge in das Loch, um Heterotransplantate zu machen. Danach bereiten Sie Homograften mit der zuvor beschriebenen Methode vor.
Wickeln Sie zunächst die veredelten Sämlinge in transparente Polyethylenbeutel, um eine relativ hohe Luftfeuchtigkeit zu erhalten. Dann die gewickelten Sämlinge sieben Tage in einer Wachstumskammer aufbewahren. Nach dem siebten Tag die Säcke entfernen und die Pflanzen sieben bis zehn Tage unter den gleichen Bedingungen wachsen lassen.
Teilen Sie die Sämlinge in zwei Gruppen auf, eine für Kältebehandlungen und eine für die Kontrolle. Bringen Sie die Kontrollsämlinge unter die gleichen Umgebungsbedingungen zurück. Legen Sie die kalt behandelten Sämlinge in eine Auf sechs Grad Celsius eingestellte Wachstumskammer mit den gleichen hellen dunklen Bedingungen wie die Kontrollgruppe.
Nach 48 Stunden die Proben des Scions und der Wurzelstöcke aus den Transplantaten lassen. Die Proben sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei minus 70 Grad Celsius lagern. Übertragen Sie die gefrorene Probe in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr in flüssigem Stickstoff.
Fügen Sie jedem Probenröhrchen eine Edelstahlperle hinzu und homogenisieren Sie das Gewebe zu einem feinen Pulver. Nehmen Sie für jede Pfropfkombination die gleichen Mengen an Gemahlenentlingen von 10 Sämlingen und mischen Sie sie in einem 10 Milliliter Zentrifugenrohr. Fügen Sie eine angemessene Menge an Guanidiumhydrochlorid-Reagenz hinzu.
Als nächstes fügen Sie RNA-freie DNase ein bis 150 Einheiten pro Milliliter bei 37 Grad Celsius für eine Stunde hinzu. Bestimmen Sie dann die gesamte RNA-Menge auf einem mikrokapillaren Elektrophoresesystem. Danach die Bibliotheksnormalisierungreagenzien und Adapter auftauen.
Dann ligate kleine RNase mit den fünf Prime und drei Prime Adapter, und elute und reinigen sie. Reverse transkribieren Sie die fünf Prime und drei Prime ligated kleine RNase nach den Richtlinien des Herstellers. Führen Sie als Nächstes die PCR-Verstärkung nach dem Herstellerprotokoll durch.
Verwenden Sie dann das mikrokailläre Elektrophoresesystem, um sicherzustellen, dass die RNA-Integritätsnummer größer als sieben ist. Laden Sie einen Mikroliter einer RNA-Bibliothek auf das mikrokapillare Elektrophoresesystem, um sicherzustellen, dass die RNA-Integritätszahl größer als sieben ist. Sequenzieren Sie schließlich die kleinen RNA-Bibliotheken auf einem Sequenzierungsinstrument mit hohem Durchsatz.
Mit diesem Protokoll wurde eine Überlebensrate von 98 % für die Transplantation und die Phänotypen für Raumtemperatur und Kaltstress-Bedingungen ermittelt. sRNAs von 24 Nukleotiden stellten die größte Klasse von sRNAs in allen Pfropfkombinationen, unabhängig von der Temperaturbehandlung. Nach 48 Stunden Kaltbehandlung waren 30 bzw. 268 microRNAs nach oben bzw. unten reguliert.
In den Blättern des Scions in Heterotransplantaten hingegen waren in den Blättern des Wurzelstocks 31 bzw. 12 MicroRNAs nach oben bzw. unten reguliert. In den Wassermelonen-Wassermelonen-Homograften waren 64 bzw. 83 MicroRNAs nach oben bzw. unten reguliert. Dies zeigte, dass Heterotransplantation eine tiefgreifende Neuprogrammierung der microRNA-Ausdrücke verursachte.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich an die relative Größe und das Alter des Tochterstiels zu erinnern und der Scion ist entscheidend für eine erfolgreiche Transplantation. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die lncRNA-Sequenzierung, die proteomische Profilierung durchgeführt werden, um die Regulation von lncRNA und Protein und das Codierungssystem im Pfropfsystem zu untersuchen. Nach seiner Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forschung auf dem Gebiet der pflanzlichen abiotischen Toleranz, um den Mechanismus der Pflanzenveredelung Vorteil in Cucurbitaceae und darüber hinaus zu erkunden.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Guanidinhydrochlorid extrem gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens sollte immer eine angemessene Vorsichtsmaßnahme getroffen werden.
