Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella risposta al miRNA alla capacità di stress negli innesti delle piante come il modo in cui il miRNA è regolato sotto stress freddo negli innesti di zucca della bottiglia di anguria. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è un metodo altamente efficiente e riproducibile per fare homo ed eterografts. Non richiede attrezzature specifiche, è molto facile da eseguire e in genere si traduce in un tasso di sopravvivenza molto elevato di innesto.
Attraverso questo metodo, può fornire informazioni sulla risposta del miRNA allo stress da freddo nel sistema di innesto della zucca della bottiglia di anguria. Può anche essere applicato ad altri organismi moderni per rivelare i meccanismi del trasporto miRNA locale e a lunga distanza. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi di innesto sono difficili da imparare.
Questo passaggio ha richiesto abilità avanzate e sono fondamentali per la sopravvivenza delle piante innestate. Per iniziare, immergere i semi di zucca della bottiglia in un bicchiere da 500 millilitri di acqua di 58 gradi Celsius. Mescolare i semi di tanto in tanto fino a quando la temperatura dell'acqua scende a 40 gradi Celsius.
Mentre l'acqua si raffredda, metti tre chilogrammi di terreno di torba in un sacchetto di nylon e autoclava. Una volta che l'acqua raggiunge la temperatura ambiente, sciacquare i semi da due a tre volte in acqua distillata e drenare l'acqua in eccesso. Lasciare germogliare i semi in un sacchetto di garza a 28 gradi Celsius nella camera di crescita scura.
Dopo la germinazione, seminare i semi in vasi di plastica riempiti con il terreno di torba sterilizzato. Quando le piantine di zucca della bottiglia sviluppano due cotyledon appiattiti, ripetere questo processo con semi di anguria. Far crescere la zucca della bottiglia e le piantine di anguria in una camera di crescita.
Aggiungere acqua alle piantine una volta al giorno nel pomeriggio. Quindi, tagliare gli ipoccotili delle piantine di anguria da due a tre centimetri sotto i cotyledon. Tagliare la parte superiore delle piantine di zucca della bottiglia sul lato, immediatamente sopra i cotyledons.
Quindi utilizzare uno stuzzicadenti per fare un buco nella parte superiore delle piantine di zucca della bottiglia tagliata. Inserire le piantine di anguria tagliate nel foro per creare eteroinnesti. Successivamente, preparare gli omoinnesti utilizzando il metodo descritto in precedenza.
In primo luogo, avvolgere le piantine innestate in sacchetti di polietilene trasparenti per mantenere un'umidità relativamente elevata. Quindi mantenere le piantine avvolte in una camera di crescita per sette giorni. Dopo il settimo giorno, rimuovere i sacchetti e consentire alle piante di crescere nelle stesse condizioni per sette o 10 giorni.
Dividere le piantine in due gruppi, uno per i trattamenti freddi e uno per il controllo. Riportare le piantine di controllo alle stesse condizioni ambientali. Posizionare le piantine trattate a freddo in una camera di crescita impostata su sei gradi Celsius con le stesse condizioni di buio chiaro del gruppo di controllo.
Dopo 48 ore, lasciare i campioni del rampollino e dei portinnesti dagli innesti. Congelare immediatamente i campioni in azoto liquido e conservarli a meno 70 gradi Celsius. Trasferire il campione congelato in un tubo di microcentrifugo a due millilitri in azoto liquido.
Aggiungere una perla in acciaio inossidabile a ciascun tubo campione e omogeneizzare i tessuti a una polvere fine. Per ogni combinazione di innesto, prendere quantità uguali di campione macinato da 10 piantine e mescolarle in un tubo di centrifuga da 10 millilitri. Aggiungere una quantità appropriata di reagente di cloridrato di guanidio.
Successivamente, aggiungere la DNasi priva di RNA da una a 150 unità per millilitro a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi determinare la quantità totale di RNA su un sistema di elettroforesi microcapillare. Successivamente, scongelare i reagenti e gli adattatori di normalizzazione della libreria.
Quindi ligate piccola RNasi con i cinque adattatori primi e tre primi, ed elutare e purificarli. Trascrivere inverso le piccole RNasi a cinque prime e tre legate prime seguendo le linee guida del produttore. Eseguire quindi l'amplificazione PCR seguendo il protocollo del produttore.
Quindi utilizzare il sistema di elettroforesi microcaillareria per garantire che il numero di integrità dell'RNA sia maggiore di sette. Caricare un microlitro di una libreria di RNA sul sistema di elettroforesi microcapillareria per garantire che il numero di integrità dell'RNA sia maggiore di sette. Infine, sequenziare le piccole librerie di RNA su uno strumento di sequenziamento ad alta velocità effettiva.
Utilizzando questo protocollo, è stato ottenuto un tasso di sopravvivenza del 98% per l'innesto e i fenotipi per la temperatura ambiente e le condizioni di stress freddo. gli sRNA di 24 nucleotidi formavano la più grande classe di sRNA in tutte le combinazioni di innesto, indipendentemente dal trattamento della temperatura. Dopo 48 ore di trattamento a freddo, 30 e 268 microRNA sono stati regolati rispettivamente verso l'alto e verso il basso.
Nelle foglie del rampollino negli eteroinnesti, al contrario, nelle foglie del portinnesti, 31 e 12 microRNA erano rispettivamente su e giù regolati. Negli omoinnesti anguria-anguria, rispettivamente 64 e 83 microRNA erano regolati verso l'alto e verso il basso. Ciò dimostrò che l'eteroinnesto causò una profonda riprogrammazione delle espressioni di microRNA.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare le dimensioni relative e l'età del gambo della figlia e il rampollino è fondamentale per fare un innesto di successo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il sequenziamento dell'lncRNA, la profilazione proteomica al fine di indagare la regolazione dell'lncRNA e della proteina e il sistema di codifica nel sistema di innesto. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo della tolleranza abiotica vegetale per esplorare il meccanismo del vantaggio di innesto delle piante nelle Cucurbitaceae e oltre.
Non dimenticare che lavorare con cloridrato di guanidina può essere estremamente pericoloso e si dovrebbero sempre prendere precauzioni appropriate con l'esecuzione di questa procedura.
