Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в miRNA ответ на способность к стрессу в растительных трансплантатов, таких как, как miRNA регулируются при холодном стрессе в арбуз бутылке тыквы трансплантатов. Основным преимуществом этой техники является то, что это высокоэффективный и воспроизводимый метод, чтобы сделать гомо и гетеротрансплантатов. Это не требует специального оборудования, это очень легко выполнить, и, как правило, приводит к очень высокой выживаемости прививки.
С помощью этого метода, может обеспечить понимание miRNA ответ на холодный стресс в арбуз бутылке тыквы трансплантата системы. Он также может быть применен к другим современным организмам для выявления механизмов местного и дальнего транспортировки миРНК. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку прививки шаги трудно узнать.
Этот шаг требует передовых навыков и являются ключом к выживанию привитых растений. Для начала замочите семена тыквы бутылки в 500 миллилитров стакан 58 градусов по Цельсию воды. Перемешать семена время от времени, пока температура воды падает до 40 градусов по Цельсию.
Пока вода остынет, положите три килограмма торфяной почвы в нейлоновый мешок и автоматически поместите его. Как только вода достигнет комнатной температуры, промыть семена два-три раза в дистиллированной воде и слейте лишнюю воду. Разрешить семена прорастать в марлевом мешке при 28 градусов по Цельсию в темной камере роста.
После прорастания, сеять семена в пластиковые горшки заполнены стерилизованной торфяной почвы. Когда саженцы тыквы бутылки разовьют два сплющенных котилендона, повторите этот процесс с семенами арбуза. Выращиваем бутылочку тыквы и саженцы арбуза в камере роста.
Добавить воду в рассаду один раз в день во второй половине дня. Затем вырежьте гипокотилы саженцев арбуза на два-три сантиметра ниже котилендонов. Вырезать верхней части бутылки тыквы саженцы на стороне, непосредственно над cotyledons.
Затем используйте зубочистку, чтобы сделать отверстие в верхней части подстриженной бутылки тыквы саженцев. Вставьте обрезанные саженцы арбуза в отверстие, чтобы сделать гетеротрансплантаты. После этого подготовь гомографты с помощью ранее описанного метода.
Во-первых, оберните привитые саженцы в прозрачные полиэтиленовые пакеты для поддержания относительно высокой влажности. Затем поддерживать завернутые саженцы в камеру роста в течение семи дней. После седьмого дня снимите мешки и дайте растениям расти в тех же условиях в течение семи-10 дней.
Разделите саженцы на две группы: одну для холодной обработки и одну для контроля. Верните контрольные саженцы в те же экологические условия. Поместите холодные обработанные саженцы в камеру роста, установленную до шести градусов по Цельсию с теми же светлыми темными условиями, что и контрольная группа.
Через 48 часов оставьте образцы отпрыска и подвоя из трансплантатов. Заморозить образцы немедленно в жидком азоте и хранить их при температуре минус 70 градусов по Цельсию. Перенесите замороженный образец в двухми миллилитровую микроцентрифугную трубку в жидком азоте.
Добавьте шарик из нержавеющей стали к каждой пробной трубке и гомогенизируйте ткани в мелкий порошок. Для каждой прививки комбинации, принять равное количество земли образца из 10 саженцев и смешать их в 10 миллилитров центрифуг трубки. Добавьте соответствующее количество гидрохлоридного реагента гуанидия.
Затем добавьте РНК-бесплатный DNase от 1 до 150 единиц на миллилитр при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. Затем определите общее количество РНК в микрокапильярной электрофорезной системе. После этого оттаивают в библиотеке нормализуемые реагенты и адаптеры.
Затем ligate небольшой RNase с пятью премьер и три премьер адаптеры, и elute и очистить их. Обратный транскрибировать пять премьер и три премьер лигатированных малых RNase следующие руководящие принципы производителя. Далее выполните усиление ПЦР в соответствии с протоколом производителя.
Затем используйте систему микрокайлярного электрофореза, чтобы гарантировать, что число целостности РНК больше семи. Загрузите один микролитер рнк-библиотеки на микрокапильярновую электрофорезную систему, чтобы гарантировать, что число целостности РНК превышает семь. Наконец, последовательность небольших библиотек РНК на инструменте секвенирования высокой пропускной способности.
Используя этот протокол, 98%выживаемость для прививки и фенотипы для комнатной температуры и холодных стрессовых условий были получены. sRNAs 24 нуклеотидов составил самый большой класс sRNAs во всех прививки комбинации, независимо от температуры лечения. После 48 часов лечения простуды, 30 и 268 микроРНК были вверх и вниз регулируется, соответственно.
В листьях отпрыска в гетеротрансплантатах, наоборот, в листьях подвоя, 31 и 12 микроРНК были вверх и вниз регулируется, соответственно. В арбузно-арбузных гомотрансплантатах, 64 и 83 микроРНК были вверх и вниз регулируется, соответственно. Это показало, что гетеротрансплантация вызвала глубокое перепрограммирование выражений микроРНК.
При попытке этой процедуры, важно помнить, относительный размер и возраст дочери стебель и отпрыск имеет решающее значение для успешного трансплантата. После этой процедуры, другие методы, такие как секвенирование lncRNA, протеомное профилирование может быть выполнено для того, чтобы исследовать регулирование lncRNA и белка и системы кодирования в системе прививки. После своего развития, этот метод проложил путь для исследований в области толерантности растений абиотических изучить механизм прививки растений преимущество в Cucurbitaceae и за его пределами.
Не забывайте, что работа с гидрохлоридом гуанидина может быть чрезвычайно опасной и при выполнении этой процедуры всегда следует принимать соответствующие меры предосторожности.
