この方法は、受容体酵素相互作用および酵素活性化における異なるタンパク質ドメインの重要性など、細胞シグナル伝達分野における重要な質問に答える手助けとなる。この技術の主な利点は、受容体酵素相互作用の併用試験と酵素活性に対するこの相互作用の機能的影響を可能にすることです。各プレートに対して、10%FBS と 1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを補った DMEM の 10 ミリリットルを使用してください。
トランスフェクションの前日、ヒト胚性腎臓293-T細胞をヘモサイトメーターを使用して12個の10センチメートルプレートに播種して細胞を数える。5%C02で摂氏37度でインキュベートします。細胞が80〜90%コンフルエントになったら、脂質ベースのトランスフェクション剤を使用して5枚のプレートをトランスフェクトする。
10センチメートルプレートの接着セルに関するメーカーの指示に従ってトランスフェクションを実行します。次に、5つのプレートの同一の第2のセットを、免疫沈降前に発現したタンパク質量の測定のための非トランスフェクト制御として機能する1つの追加プレートと共にトランスフェクトする。トランスフェクトしたプレートを5%CO2で摂氏37度の組織培養インキュベーターに48時間インキュベートします。
蛍光顕微鏡を使用して、細胞のGFP発現を調べ、トランスフェクションが正常に行われたことを確認します。15マイクロリットルの100ミリモルナトリウムオルソバナデートを50マイクロリットルの過酸化水素と混合し、新鮮なパーバナデート混合物を調製します。タグ付きバージョンのPD-1をリン酸化するには、PD-1-GFPトランスフェクト細胞から培地を取り出します。
各プレートに10ミリリットルのプレーンDMEMと10マイクロリットルのパーバナデートを加えます。室温で暗闇の中で15分間インキュベートします。この後、1回のPBSを5ミリリットルで氷冷PBSで3回洗浄します。
免疫沈降を行っている間、すべてのステップは氷の上または摂氏4度で行われるべきである。10ミリリットルのバッファーに1錠の阻害剤を溶解することにより、プロテアーゼ阻害剤で溶解バッファーを補います。また、PD-1-GFPトランスフェクトプレートで使用されるバッファーにオルソバナデートナトリウムの1ミリモルを追加します。
500マイクロリットルの氷冷ライシスバッファーを細胞に加え、オルソバナデートナトリウムを含むリシスバッファーをPD-1-GFPトランスフェクト細胞を含むプレートのみに追加します。セルスクレーパーを使用して、すぐにプレートからセルを取り出して収集します。ライセートを1.5ミリリットルの冷たいチューブに移し、0.005倍の重力と摂氏4度で30分間回転させます。
ライセートからポスト核上清を集めるには、重力10,000倍、摂氏4度で10分間回転させます。上清を新しいチューブに移し、ペレットを捨てます。後で WCL 解析を行う場合は、6 枚のプレートの 2 番目のプレートの上清を氷の上に保存します。
抗GFPビーズの準備を始めるには、ビーズを入ったボトルを軽く振ってから開けて落ち着きを防ぎます。各条件ごとにスラリーから40マイクロリットルの抗GFPビーズを取り除きます。500倍の重力で遠心分離機、摂氏4度で3分間。
上清を取り除いてビーズを洗い、ピペットとビーズの接触を最小限に抑え、損失を防ぎます。サンプルごとに80マイクロリットルのリシスバッファーでビーズを再懸濁します。洗浄ビーズを、4枚のプレートの最初のセットのPD-1-GFP発現細胞から細胞ライセートに直接添加する。
重力0.005倍の摂氏4度で30分回転し、GFPタグ付きタンパク質を免疫沈降させます。洗浄ごとにオルソバナデートを含まない冷たいリシスバッファーを1ミリリットル使用してビーズを3回洗浄します。その後、2、500倍の重力で遠心分離機を10秒間行う。
アクティブなSHP2のライセートをプレートの最初のセットから3つの等しい部分に分割し、洗浄されたPD-1-GFP含有ビーズを含む3つのチューブのそれぞれに部分を加える。非トランスフェクトされた細胞からのライセート体積の1/3を野生型PD-1-GFPビーズの第2のチューブに加える。残りの 2/3 を破棄します。
0.005倍の重力で穏やかな回転で4°Cでビーズを4時間インキュベートします。この後、洗浄ごとに1ミリリットルの冷たいリシスバッファーを使用してビーズを2回洗浄します。各サンプルに80マイクロリットルのライシスバッファーを加え、各チューブの総体積が100マイクロリットルであることを確認します。
カットピペットチップを使用して、ピペットを上下に軽く混ぜます。その後、各チューブから50マイクロリットルを2つの新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移します。ビーズをホスファターゼ洗浄バッファーで一度洗います。
その後、上清を完全に取り除く。ビーズに100マイクロリットルのアッセイバッファーを加え、穏やかな攪拌の下で30°Cで30分間インキュベートします。バッファーが黄色に変わったら、水酸化ナトリウムの1モル溶液の50マイクロリットルを加えて反応を終了する。
2、500倍の重力で10秒間遠心分離機。この後、上清を96ウェルプレートの半分のウェルに移します。405ナノメートルの吸収剤を読み、PD-1-GFPの制御野生型バージョンに対する相対的な光学密度として結果を表現する。
最初にビーズを2,000倍の重力で回転させ、摂氏4度で30秒間回転させ、上清を取り除きます。2倍のレムリバッファーの20マイクロリットルを追加し、5分間摂氏95度で沸騰させます。BCAキットを使用して、入力コントロールのタンパク質濃度を測定します。
最も希釈したサンプルの30マイクロリットルを新しいチューブに移します。リシスバッファーを使用して、入力コントロールの残りの部分を最も希釈したサンプルと同じ濃度に希釈します。次に、希釈された各入力コントロールの30マイクロリットルを新しいチューブに移します。
ライゼトに2倍のレムリバッファーの等量を追加し、5分間摂氏95度を沸騰させます。この後、テキストプロトコルで概説されているようにウェスタンブロット分析を実行する前に、ビーズを2,000倍の重力と摂氏4度で30秒間回転させます。本研究では、受容体酵素相互作用と活性化の並列評価のために、共免疫沈降法と酵素活性アッセイを組み合わせて開発した。
当然のことながら、ITSMが変異したときにSHP2はPD-1に結合できませんでした。驚くべきことに、ITIMの変異型バージョンは限られた範囲でのみSHP2結合を阻害した。それにもかかわらず、SHP2-ホスファターゼ活性アッセイは、ITIMとITSMが酵素活性のために同様に不可欠であることを明らかにします。
これにより、SHP2が安静条件下で自動抑制された立体構造に折り畳まれる2段階の活性化モデルが明らかになる。PD-1の活性化時に、SHP2はリン酸化ITSMにリクルートされる。しかし、ITIMは、SHP2をその活発な立体構造に展開するためにリン酸化されなければならない。
その開発後、この技術は、細胞シグナル伝達の分野の研究者が受容体と酵素相互作用におけるタンパクドメインの機能を探求する道を開くことができます。
