Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сигнализации клеток, такие как важность различных белковых областей в взаимодействии ферментов рецепторов и ферментной активации. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет сопутствуя тестированию взаимодействия ферментов рецепторов и функциональных последствий этого взаимодействия на активность фермента. Для каждой пластины используйте 10 миллилитров DMEM, дополненных 10%FBS и 1%пенициллином и стрептомицином.
За день до трансфекции семенная эмбриональная почка человека 293-Т-клетки в 12 10-сантиметровых пластин с использованием гемоцитометра для подсчета клеток. Инкубация при 37 градусах по Цельсию в 5%C02. После того, как клетки от 80 до 90% стечения, использовать липид на основе трансфекции агента для трансфекции пять пластин.
Выполните трансфекцию в соответствии с инструкциями производителя по присоединению ячеек в 10-сантиметровых пластинах. Затем трансфект идентичный второй набор из пяти пластин вместе с одной дополнительной пластиной, выступающей в качестве нетрансфицированного контроля для измерения выраженного количества белка до иммунопреципиентации. Инкубировать трансфицированные пластины в инкубаторе культуры тканей при 37 градусах по Цельсию в 5%CO2 в течение 48 часов.
Используйте флуоресцентный микроскоп для изучения клеток для экспрессии GFP и обеспечения трансфекции успешно произошло. Смешайте 15 микролитров 100-миллимолярной ортованата натрия с 50 микролитров 30%перекиси водорода, чтобы подготовить свежую смесь перванадата. Для фосфорилировать помеченные версии PD-1, удалить средства массовой информации из PD-1-GFP трансфицированных клеток.
Добавьте 10 миллилитров простого DMEM и 10 микролитров перваната к каждой пластине. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. После этого, мыть клетки три раза в ледяной PBS с помощью пяти миллилитров PBS за стирку.
При выполнении иммунопреципиентации все шаги должны выполняться либо на льду, либо при четырех градусах Цельсия. Дополнить буфер лиза ингибиторами протеазы, растворив одну таблетку ингибиторов в 10 миллилитров буфера. Кроме того, добавить один миллимоляр натрия ортованадат в буфер, который будет использоваться на PD-1-GFP-трансфицированных пластин.
Добавьте 500 микролитров ледяного буфера лиза в клетки, убедившись, что добавить буфер лиза, содержащий ортованата натрия только пластины, содержащие PD-1-GFP-трансфицированных клеток. Используйте сотовый скребок, чтобы немедленно удалить и собрать клетки из пластин. Перенесите лисаты в 1,5-миллилитровые холодные трубки и поверните их в 0,005 раза тяжести и при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут.
Чтобы собрать супернатант после ядра из ликатов, вращайте их вниз при 10 000 раз гравитации и четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. Перенесите супернатанты в новые трубки и отбросьте гранулы. Храните супернатанты для второго набора из шести пластин на льду для более длительного анализа WCL.
Чтобы начать подготовку анти-GFP бусы, осторожно встряхните бутылку, содержащую бисер перед открытием, чтобы предотвратить урегулирование. Удалите 40 микролитров анти-GFP шарики из суспензии на каждое условие. Центрифуга при 500-времени гравитации и четыре градуса по Цельсию в течение трех минут.
Удалите супернатант для мытья бисера, убедившись, чтобы свести к минимуму контакт между пипеткой и бисером, чтобы предотвратить потерю. Перепродюсатор бисера в 80 микролитров буфера лиза на образец. Добавьте вымытые бусы непосредственно в лизат клетки из клеток PD-1-GFP-экспрессии первого набора из четырех пластин.
Поверните в 0,005 раза тяжести в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию, чтобы иммунопреципилитировать GFP-тегами белков. Вымойте бисер три раза, используя один миллилитр холодного лиза буфера, который не содержит ортованата для каждого мытья. Затем центрифуга при 2500 раз больше гравитации в течение 10 секунд.
Разделите лизат активного SHP2 из первого набора пластин на три равные части и добавьте часть к каждой из трех трубок, содержащих промытые PD-1-GFP-содержащие бусы. Добавьте 1/3 объема лизита из нетрансфицированных клеток во вторую трубку дикого типа, PD-1-GFP шарики. Отбросьте оставшиеся 2/3.
Инкубировать бисер в течение четырех часов при четырех градусах по Цельсию с нежным вращением в 0,005 раза тяжести. После этого, мыть бисер в два раза с помощью одного миллилитра холодного лиза буфера для каждого мытья. Добавьте 80 микролитров буфера лиза в каждый образец, гарантируя, что общий объем в каждой трубке составляет 100 микролитров.
Используя наконечник пипетки, пипетку аккуратно вверх и вниз, чтобы смешать. Затем перенесите 50 микролитров из каждой трубки в две, свежие, 1,5 миллилитровые трубки. Вымойте бисер один раз с фосфатазы мыть буфер.
Затем удалите супернатант полностью. Добавьте 100 микролитров буфера анализа в бисер и инкубировать при 30 градусах по Цельсию в течение 30 минут под нежным возбуждением. Когда буфер желтеет, прекратите реакцию, добавив 50 микролитров одного молярного раствора гидроксида натрия.
Центрифуга при 2500 раз больше гравитации в течение 10 секунд. После этого перенесите супернатант на две скважины половины площади в пластине из 96 скважин. Прочитайте абсорбенты на 405 нанометров и выразить результаты, как относительная оптическая плотность над контролем дикого типа версии PD-1-GFP.
Первый спина вниз шарики на 2000 раз тяжести и четыре градуса по Цельсию в течение 30 секунд и удалить супернатант. Добавьте 20 микролитров в два раза буфер Laemmli и кипятить при 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Используя комплект BCA, измерьте концентрацию протеина управления входного сигнала.
Перенесите 30 микролитров наиболее разбавленного образца в новую трубку. Используйте буфер лиза, чтобы разбавить остальные элементы управления ввода до той же концентрации, что и наиболее разбавленный образец. Затем перенесите 30 микролитров каждого из разбавленных элементов управления ввода в новую трубку.
Добавить равные объемы в два раза Laemmli буфер лизирует и варить их 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. После этого, спина вниз бисера в 2000 раз тяжести и четыре градуса по Цельсию в течение 30 секунд, прежде чем выполнять анализ западной пятно, как указано в текстовом протоколе. В этом исследовании для параллельной оценки взаимодействий и активации рецепторов разработан комбинированный анализ ко-иммунопреципиентации и ферментной активности.
Неудивительно, что SHP2 не удалось связать с PD-1, когда ITSM мутировал. Примечательно, что мутантная версия ITIM препятствовала связыванию SHP2 лишь в ограниченной степени. Тем не менее, анализ активности SHP2-phosphatase показывает, что ITIM и ITSM одинаково незаменимы для энзиматической деятельности.
Это показывает двухшаговую модель активации, в которой SHP2 складывается в автоматическую конформацию в условиях покоя. После активации PD-1, SHP2 набирается в фосфорилированных ITSM. Тем не менее, ITIM также должны быть фосфорилированы, чтобы развернуть SHP2 в его активной конформации.
После его развития, этот метод может проложить путь для исследователей в области сигнализации клеток, чтобы исследовать функцию белковых доменов в рецепторно-ферментных взаимодействий.
