Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de sinalização celular, como a importância de diferentes domínios proteicos na interação entre enzimas receptoras e ativação enzimática. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite testes concomitantes de interações entre enzimas receptoras e as consequências funcionais dessa interação na atividade enzimápica. Para cada placa, utilize 10 mililitros de DMEM suplementados com 10% FBS e 1%penicilina e estreptomicina.
Um dia antes da transfecção, as células embrionárias humanas 293-T em 12 placas de 10 centímetros usando um hemótmetro para contar as células. Incubar a 37 graus Celsius em 5%C02. Uma vez que as células sejam 80 a 90% confluentes, use um agente de transfecção à base de lipídio para transfetar cinco das placas.
Realize a transfecção seguindo as instruções do fabricante para células de adesão em placas de 10 centímetros. Em seguida, transfem um segundo conjunto idêntico de cinco placas, juntamente com uma placa adicional servindo como um controle não transtrafetado para a medição da quantidade de proteína expressa antes da imunoprecipitação. Incubar as placas transfeinadas em uma incubadora de cultura tecidual a 37 graus Celsius em 5% de CO2 por 48 horas.
Use um microscópio fluorescente para examinar as células para a expressão GFP e garantir que a transfecção tenha ocorrido com sucesso. Misture 15 microlitadores de ortovanadato de sódio de 100 milimolares com 50 microlitadores de peróxido de hidrogênio de 30% para preparar uma mistura fresca de pervanadato. Para fosforilar as versões marcadas do PD-1, remova a mídia das células transfecidas PD-1-GFP.
Adicione 10 mililitros de DMEM simples e 10 microliters de pervanadate a cada placa. Incubar no escuro à temperatura ambiente por 15 minutos. Depois disso, lave as células três vezes em PBS gelado usando cinco mililitros de PBS por lavagem.
Durante a realização da imunoprecipitação, todas as etapas devem ser realizadas no gelo ou em quatro graus Celsius. Suplemente o tampão de lise com inibidores de protease dissolvendo um comprimido dos inibidores em 10 mililitros de tampão. Adicione também um milimão de ortovanadato de sódio ao tampão que será usado nas placas transfecidas PD-1-GFP.
Adicione 500 microliters de tampão de lise gelada às células, certificando-se de adicionar o tampão de lise contendo a ortovanadate de sódio apenas às placas contendo células transfectadas PD-1-GFP. Use um raspador de células para remover imediatamente e coletar as células das placas. Transfira os lises em tubos frios de 1,5 mililitro e gire-os a 0,005 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por 30 minutos.
Para coletar o supernanato pós-núcleo dos lises, gire-os a 10.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 10 minutos. Transfira os supernantes em novos tubos e descarte a pelota. Armazene os supernacantes para o segundo conjunto de seis placas no gelo para análise posterior do WCL.
Para começar a preparar contas anti-GFP, agite suavemente a garrafa contendo as contas antes de abrir para evitar a fixação. Remova 40 microliters das contas anti-GFP do chorume por cada condição. Centrífuga a 500 vezes a gravidade e 4 graus Celsius por três minutos.
Remova o supernatante para lavar as contas, certificando-se de minimizar o contato entre a pipeta e as contas para evitar perdas. Resuspenja as contas em 80 microliters de tampão de lise por amostra. Adicione as contas lavadas diretamente ao lisecelular das células expressas PD-1-GFP do primeiro conjunto de quatro placas.
Gire a 0,005 vezes a gravidade por 30 minutos a quatro graus Celsius para imunoprecipitar as proteínas marcadas pelo GFP. Lave as contas três vezes usando um mililitro de tampão de lise fria que não contenha ortovanadato para cada lavagem. Em seguida, centrífuga a 2.500 vezes gravidade por 10 segundos.
Divida o lise do SHP2 ativo do primeiro conjunto de placas em três porções iguais e adicione uma porção a cada um dos três tubos contendo as contas que contêm PD-1-GFP lavadas. Adicione 1/3 do volume de lise das células não transtravadas ao segundo tubo das contas de PD-1-GFP do tipo selvagem. Descarte o 2/3 restante.
Incubar as contas por quatro horas a quatro graus Celsius com rotação suave a 0,005 vezes a gravidade. Depois disso, lave as contas duas vezes usando um mililitro de tampão de lise fria para cada lavagem. Adicione 80 microliters de tampão de lise a cada amostra, garantindo que o volume total em cada tubo seja de 100 microliters.
Usando uma ponta de pipeta cortada, pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar. Em seguida, transfira 50 microliters de cada tubo em dois tubos frescos, frescos, 1,5 mililitros. Lave as contas uma vez com tampão de lavagem de fosfatase.
Em seguida, remova o supernatante completamente. Adicione 100 microliters de tampão de ensaio às contas e incubar a 30 graus Celsius por 30 minutos sob suave agitação. Quando o tampão ficar amarelo, termine a reação adicionando 50 microliters de uma solução molar de hidróxido de sódio.
Centrífuga a 2.500 vezes a gravidade por 10 segundos. Depois disso, transfira o supernatante para dois poços de meia área em uma placa de 96 poços. Leia os absorventes em 405 nanômetros e expresse os resultados como densidade óptica relativa sobre a versão de controle do tipo selvagem do PD-1-GFP.
Primeiro gire as contas a 2.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 30 segundos e remova o supernaspe. Adicione 20 microliters de duas vezes tampão Laemmli e ferva a 95 graus Celsius por cinco minutos. Utilizando um kit BCA, meça a concentração proteica dos controles de entrada.
Transfira 30 microliters da amostra mais diluída para um novo tubo. Use tampão de lise para diluir o resto dos controles de entrada para a mesma concentração da amostra mais diluída. Em seguida, transfira 30 microliters de cada um dos controles de entrada diluídos para um novo tubo.
Adicione volumes iguais de dois vezes tampão laemmli aos lises e ferva-os 95 graus Celsius por cinco minutos. Depois disso, gire as contas a 2.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 30 segundos antes de realizar a análise do Western Blot, conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, desenvolve-se um ensaio combinado de co-imunoprecipitação e atividade enzimática para a avaliação paralela das interações e ativações das enzimas receptoras.
Sem surpresa, o SHP2 não se vinculou ao PD-1 quando o ITSM sofreu mutação. Notavelmente, a versão mutante do ITIM inibiu a ligação SHP2 apenas em uma extensão limitada. No entanto, o ensaio de atividade SHP2-fosfates revela que o ITIM e o ITSM são igualmente indispensáveis para a atividade enzimática.
Isso revela um modelo de ativação de duas etapas no qual o SHP2 é dobrado em uma conformação autoinibida em condições de repouso. Após a ativação do PD-1, o SHP2 é recrutado para o ITSM fosforilado. No entanto, o ITIM também deve ser fosfoilado para desdobrar SHP2 em sua conformação ativa.
Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores do campo da sinalização celular explorarem a função dos domínios proteicos nas interações receptor-enzimas.
