Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Zellsignalbereich zu beantworten, wie z. B. die Bedeutung verschiedener Proteindomänen in der Interaktion mit Rezeptorenzymen und der enzymatischen Aktivierung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie gleichzeitige Tests von Rezeptorenzym-Wechselwirkungen und die funktionellen Folgen dieser Wechselwirkung auf die Enzymaktivität ermöglicht. Verwenden Sie für jede Platte 10 Milliliter DMEM, ergänzt mit 10%FBS und 1%penicillin und Streptomycin.
Am Tag vor der Transfektion samen menschliche embryonale Niere 293-T-Zellen in 12 10-Zentimeter-Platten mit einem Hämozytometer, um die Zellen zu zählen. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius in 5%C02. Sobald die Zellen 80 bis 90 % konfluent sind, verwenden Sie ein lipidbasiertes Transfektionsmittel, um fünf der Platten zu transfekieren.
Führen Sie die Transfektion gemäß den Anweisungen des Herstellers für Haftzellen in 10-Zentimeter-Platten durch. Dann transfezieren Sie einen identischen zweiten Satz von fünf Platten zusammen mit einer zusätzlichen Platte, die als nicht transfizierte Kontrolle für die Messung der exprimierten Proteinmenge vor der Immunpräzipitation dient. Inkubieren Sie die transfizierten Platten in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5% CO2 für 48 Stunden.
Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die Zellen auf GFP-Expression zu untersuchen und sicherzustellen, dass die Transfektion erfolgreich stattgefunden hat. Mischen Sie 15 Mikroliter 100-Millimolar-Natriumorthovanadate mit 50 Mikroliter n.B. 30% Wasserstoffperoxid, um ein frisches Pervanadate-Gemisch herzustellen. Um die markierten Versionen von PD-1 zu phosphorylieren, entfernen Sie das Medium aus den transfizierten PD-1-GFP-Zellen.
Fügen Sie 10 Milliliter reines DMEM und 10 Mikroliter Pervanadate zu jeder Platte hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Danach die Zellen dreimal in eiskaltem PBS mit fünf Millilitern PBS pro Waschgang waschen.
Bei der Durchführung der Immunpräzipitation sollten alle Schritte entweder auf Eis oder bei vier Grad Celsius durchgeführt werden. Ergänzen Sie den Lysepuffer mit Proteasehemmern, indem Sie eine Tablette der Inhibitoren in 10 Milliliter Puffer auflösen. Fügen Sie dem Puffer, der auf den PD-1-GFP-transfizierten Platten verwendet wird, auch ein Millimolar Natriumorthovanadate hinzu.
Fügen Sie den Zellen 500 Mikroliter eiskalteLysepuffer hinzu, um den Lysepuffer, der das Natriumorthovanadate enthält, nur den Platten hinzuzufügen, die PD-1-GFP-transfizierte Zellen enthalten. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen sofort zu entfernen und von den Platten zu sammeln. Die Lysate in 1,5-Milliliter-Kaltrohre geben und 30 Minuten lang bei 0,005-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius drehen.
Um den Post-Nuklei-Überstand aus den Lysaten zu sammeln, drehen Sie sie bei 10.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Übertragen Sie die Überräube in neue Schläuche und entsorgen Sie das Pellet. Bewahren Sie die Überräube für den zweiten Satz von sechs Platten auf Eis für die spätere WCL-Analyse auf.
Um mit der Vorbereitung von Anti-GFP-Perlen zu beginnen, schütteln Sie die Flasche mit den Perlen vor dem Öffnen vorsichtig, um eine Absetzung zu verhindern. Entfernen Sie 40 Mikroliter der Anti-GFP-Perlen aus der Gülle pro Zustand. Zentrifuge bei 500-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius für drei Minuten.
Entfernen Sie den Überstand, um die Perlen zu waschen, und stellen Sie sicher, dass der Kontakt zwischen der Pipette und den Perlen minimiert wird, um Verlust zu vermeiden. Resuspend ieren die Perlen in 80 Mikroliter Lysepuffer pro Probe. Fügen Sie die gewaschenen Perlen direkt in das Zelllysat aus den PD-1-GFP-exemitten Zellen des ersten Satzes von vier Platten hinzu.
Drehen Sie bei 0,005-facher Schwerkraft 30 Minuten bei vier Grad Celsius, um die GFP-markierten Proteine zu immunisieren. Waschen Sie die Perlen dreimal mit einem Milliliter Kaltlysepuffer, der kein Orthovanadate für jede Wäsche enthält. Dann Zentrifuge bei 2, 500 mal Schwerkraft für 10 Sekunden.
Teilen Sie das Lysat des aktiven SHP2 aus dem ersten Satz der Platten in drei gleiche Portionen und fügen Sie jedem der drei Rohre, die die gewaschenen PD-1-GFP-haltigen Perlen enthalten, einen Teil hinzu. Fügen Sie 1/3 des Lysatvolumens aus den nicht transfizierten Zellen in die zweite Röhre der Wildtyp-, PD-1-GFP-Perlen. Entsorgen Sie die restlichen 2/3.
Bebrüte die Perlen vier Stunden lang bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation bei 0,005-facher Schwerkraft. Danach die Perlen zweimal mit einem Milliliter Kaltlysepuffer für jede Wäsche waschen. Fügen Sie 80 Mikroliter Lysepuffer zu jeder Probe hinzu, um sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen in jedem Rohr 100 Mikroliter beträgt.
Mit einer geschnittenen Pipettenspitze, Pipette sanft nach oben und unten zu mischen. Dann 50 Mikroliter aus jedem Rohr in zwei, frische, 1,5 Milliliter Röhren übertragen. Waschen Sie die Perlen einmal mit Phosphatase-Waschpuffer.
Entfernen Sie dann den Überstand vollständig. Fügen Sie 100 Mikroliter Assaypuffer zu den Perlen hinzu und brüten bei 30 Grad Celsius 30 Minuten lang unter sanfter Erregung. Wenn der Puffer gelb wird, beenden Sie die Reaktion, indem Sie 50 Mikroliter einer Mollösung Natriumhydroxid hinzufügen.
Zentrifuge bei 2, 500-mal Schwerkraft für 10 Sekunden. Danach den Überstand in zwei Brunnen der halben Fläche in einer 96-Well-Platte übertragen. Lesen Sie die Absorptionsstoffe bei 405 Nanometern und drücken Sie die Ergebnisse als relative optische Dichte über die Kontroll-Wild-Typ-Version von PD-1-GFP aus.
Drehen Sie zuerst die Perlen bei 2.000 Mal Schwerkraft und vier Grad Celsius für 30 Sekunden und entfernen Sie den Überstand. 20 Mikroliter des zweifachen Laemmli-Puffers hinzufügen und bei 95 Grad Celsius fünf Minuten kochen. Messen Sie mit einem BCA-Kit die Proteinkonzentration der Eingangskontrollen.
Übertragen Sie 30 Mikroliter der am häufigsten verdünnten Probe in ein neues Rohr. Verwenden Sie den Lysepuffer, um den Rest der Eingabesteuerungen auf die gleiche Konzentration wie die am häufigsten verdünnte Probe zu verdünnen. Dann übertragen Sie 30 Mikroliter jeder der verdünnten Eingangssteuerungen in ein neues Rohr.
Fügen Sie den Lysaten gleiche Volumina von zwei Mal Laemmli-Puffer hinzu und kochen Sie sie fünf Minuten lang um 95 Grad Celsius. Danach drehen Sie die Perlen bei 2.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius für 30 Sekunden, bevor Sie western Blot-Analysen durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wird ein kombinierter Co-Immunpräzipations- und enzymatischer Aktivitätstest für die parallele Bewertung von Rezeptorenzym-Wechselwirkungen und -Aktivierung entwickelt.
Es überrascht nicht, dass SHP2 nicht an PD-1 gebunden werden konnte, als ITSM mutierte. Bemerkenswerterweise hemmte die mutierte Version der ITIM die SHP2-Bindung nur bedingt. Dennoch zeigt der SHP2-Phosphatase-Aktivitätstest, dass ITIM und ITSM für die enzymatische Aktivität gleichermaßen unverzichtbar sind.
Dies zeigt ein zweistufiges Aktivierungsmodell, bei dem SHP2 unter Ruhebedingungen in eine autohemmte Konformation gefaltet wird. Nach Aktivierung von PD-1 wird SHP2 an das phosphorylierte ITSM rekrutiert. Das ITIM muss jedoch auch phosphoryliert werden, um SHP2 in seine aktive Konformation zu entfalten.
Nach seiner Entwicklung kann diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellsignalisierung ebnen, um die Funktion von Proteindomänen in Rezeptor-Enzym-Wechselwirkungen zu erforschen.
