Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización celular, como la importancia de diferentes dominios de proteínas en la interacción de enzimas receptoras y la activación enzimática. La principal ventaja de esta técnica es que permite pruebas concomitantes de interacciones enzimáticas receptoras y las consecuencias funcionales de esta interacción en la actividad enzimática. Para cada placa, utilice 10 mililitros de DMEM complementados con 10%FBS y 1%penicilina y estreptomicina.
El día antes de la transfección, siembra células embrionarias humanas 293-T en 12 placas de 10 centímetros usando un hemocitoómetro para contar las células. Incubar a 37 grados centígrados en 5%C02. Una vez que las células son de 80 a 90%confluentes, utilice un agente de transfección a base de lípidos para transfecar cinco de las placas.
Realice la transfección siguiendo las instrucciones del fabricante para las células de adherencia en placas de 10 centímetros. A continuación, transfectar un segundo juego idéntico de cinco placas junto con una placa adicional que sirve como un control no trans infectado para la medición de la cantidad de proteína expresada antes de la inmunoprecipitación. Incubar las placas trans infectadas en una incubadora de cultivo tisular a 37 grados celsius en 5%CO2 durante 48 horas.
Utilice un microscopio fluorescente para examinar las células en busca de expresión de GFP y asegurarse de que la transfección se ha producido correctamente. Mezclar 15 microlitros de ortolada de sodio de 100 milimotoras con 50 microlitros de peróxido de hidrógeno al 30% para preparar una mezcla de pervanato fresco. Para fosforilar las versiones etiquetadas de PD-1, elimine los medios de las células trans infectadas PD-1-GFP.
Añadir 10 mililitros de DMEM liso y 10 microlitros de pervanada a cada placa. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de esto, lave las células tres veces en PBS helado usando cinco mililitros de PBS por lavado.
Durante la realización de la inmunoprecipitación, todos los pasos deben realizarse en hielo o a cuatro grados centígrados. Complementar el tampón de la lesis con inhibidores de la proteasa disolviendo un comprimido de los inhibidores en 10 mililitros de tampón. Agregue también un mililolar de ortovanato de sodio al tampón que se utilizará en las placas transinfectantes PD-1-GFP.
Añadir 500 microlitros de tampón de lysis helada a las células, asegurándose de añadir el tampón de lelisis que contiene la ortolada de sodio a sólo las placas que contienen células transinfectantes PD-1-GFP. Utilice un rascador de células para extraer y recoger inmediatamente las células de las placas. Transfiera los lysates en tubos fríos de 1,5 mililitros y gírelos a 0,005 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.
Para recoger el sobrenadante post-núcleos de los lysates, gíralos a 10.000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Transfiera los sobrenadantes a tubos nuevos y deseche el pellet. Almacene los sobrenadantes para el segundo conjunto de seis placas en hielo para su posterior análisis de LA WCL.
Para comenzar a preparar cuentas anti-GFP, agita suavemente el frasco que contiene las perlas antes de abrirla para evitar el sedimento. Retire 40 microlitros de las perlas anti-GFP de la suspensión por cada condición. Centrifugar a 500 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante tres minutos.
Retire el sobrenadante para lavar las perlas, asegurándose de minimizar el contacto entre la pipeta y las perlas para evitar la pérdida. Resuspender las perlas en 80 microlitros de tampón de lelisis por muestra. Agregue las perlas lavadas directamente al lesate celular de las células que expresan PD-1-GFP del primer conjunto de cuatro placas.
Gire a 0.005 veces la gravedad durante 30 minutos a cuatro grados Celsius para inmunoprecipitar las proteínas etiquetadas con GFP. Lave las cuentas tres veces con un mililitro de tampón de lelisis fría que no contenga ortovanato para cada lavado. Luego centrifugar a 2.500 veces la gravedad durante 10 segundos.
Divida el el sulfato del SHP2 activo del primer conjunto de placas en tres porciones iguales y agregue una porción a cada uno de los tres tubos que contienen las perlas lavadas que contienen PD-1-GFP. Agregue 1/3 del volumen de izado de las células no tractivas al segundo tubo de las perlas PD-1-GFP de tipo salvaje. Deseche el 2/3 restante.
Incubar las perlas durante cuatro horas a cuatro grados centígrados con rotación suave a 0.005 veces la gravedad. Después de esto, lave las cuentas dos veces usando un mililitro de tampón de lelisis fría para cada lavado. Añadir 80 microlitros de tampón de lelisis a cada muestra, asegurando que el volumen total en cada tubo es de 100 microlitros.
Con una punta de pipeta cortada, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. A continuación, transfiera 50 microlitros de cada tubo a dos tubos frescos de 1,5 mililitros. Lave las cuentas una vez con el tampón de lavado de fosfatasa.
A continuación, retire el sobrenadante por completo. Agregue 100 microlitros de tampón de ensayo a las perlas e incubar a 30 grados Centígrados durante 30 minutos bajo agitación suave. Cuando el tampón se vuelva amarillo, termine la reacción añadiendo 50 microlitros de una solución molar de hidróxido de sodio.
Centrifugar a 2.500 veces la gravedad durante 10 segundos. Después de esto, transfiera el sobrenadante en dos pozos de media área en una placa de 96 pozos. Lea los absorbentes a 405 nanómetros y exprese los resultados como densidad óptica relativa sobre la versión de control de tipo salvaje de PD-1-GFP.
Primero gira las cuentas a 2.000 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante 30 segundos y retira el sobrenadante. Añadir 20 microlitros de dos veces tampón Laemmli y hervir a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Con un kit BCA, mida la concentración proteica de los controles de entrada.
Transfiera 30 microlitros de la muestra más diluida a un tubo nuevo. Utilice el búfer de lelisis para diluir el resto de los controles de entrada a la misma concentración que la muestra más diluida. A continuación, transfiera 30 microlitros de cada uno de los controles de entrada diluidos a un nuevo tubo.
Añadir volúmenes iguales de dos veces la tampli tampón a los lisatos y hervirlos 95 grados Celsius durante cinco minutos. Después de esto, gire hacia abajo las cuentas a 2.000 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante 30 segundos antes de realizar el análisis de Western Blot como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, se desarrolla un ensayo combinado de co-inmunoprecipitación y actividad enzimática para la evaluación paralela de las interacciones y activación de enzimas receptoras.
Como era de esperar, SHP2 no se adhiró al PD-1 cuando el ITSM fue mutado. Sorprendentemente, la versión mutante del ITIM inhibió la unión SHP2 sólo en una medida limitada. Sin embargo, el ensayo de actividad SHP2-fosfatasa revela que el ITIM y el ITSM son igualmente indispensables para la actividad enzimática.
Esto revela un modelo de activación en dos pasos en el que SHP2 se pliega en una conformación autoinhibitada en condiciones de reposo. Tras la activación del PD-1, SHP2 es reclutado para el ITSM fosforilado. Sin embargo, el ITIM también debe ser fosforilado para desplegar SHP2 en su conformación activa.
Después de su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de la señalización celular exploren la función de los dominios proteicos en las interacciones entre receptores y enzimas.
