Bu yöntem, reseptör enzim etkileşimi ve enzimaktivasyonunda farklı protein alanlarının önemi gibi hücre sinyalizasyon alanındaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, reseptör enzim etkileşimlerinin ve bu etkileşimin enzim aktivitesi üzerindeki fonksiyonel sonuçlarının birlikte test edilmesine olanak sağlamasıdır. Her plaka için 10 mililitre DMEM kullanın ve %10 FBS ve %1 penisilin ve streptomisin ile tamamlanır.
Transfeksiyondan bir gün önce, insan embriyonik böbrek 293-T hücrelerini 12 10 santimetrelik plakalara hemositometre kullanarak hücreleri saymak için tohum. %5 C02'de 37 derecede kuluçkaya yat. Hücreler %80 ila %90 oranında konfluent olduktan sonra, plakaların beşini transfect etmek için lipid bazlı transfeksiyon ajanı kullanın.
10 santimetrelik plakalarda yapışma hücreleri için üreticinin talimatları aşağıdaki transfection gerçekleştirin. Daha sonra, immünopresimadan önce ifade edilen protein miktarının ölçümü için transfected olmayan bir kontrol görevi veren ek bir plaka ile birlikte beş plakadan oluşan aynı ikinci seti transfect. Bir doku kültürü kuluçka makinesinde transfected plakaları 48 saat boyunca %5 CO2'de 37 derecede kuluçkaya yatırın.
GFP ekspresyonu için hücreleri incelemek ve transfeksiyonun başarıyla meydana geldiğinden emin olmak için floresan mikroskop kullanın. Taze bir pervanaat karışımı hazırlamak için 15 mikrolitre 100 milimolar sodyum ortoovanadate ile %30 hidrojen peroksit 50 mikrolitre karıştırın. PD-1'in etiketli sürümlerini fosforilasyona çıkarmak için, ortamı PD-1-GFP transfected hücrelerden çıkarın.
Her plakaya 10 mililitre düz DMEM ve 10 mikrolitre pervanat ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. Bundan sonra, yıkama başına beş mililitre PBS kullanarak hücreleri buz gibi PBS'de üç kez yıkayın.
İmmünoenaz yapılırken tüm adımlar buzüzerinde veya dört santigrat derecede yapılmalıdır. 10 mililitre tampon inhibitörleri bir tablet eriterek proteaz inhibitörleri ile lysis tampon tamam. Ayrıca PD-1-GFP-transfected plakalar kullanılacak tampon sodyum orthovanadate bir milimolar ekleyin.
Hücrelere 500 mikrolitre buz gibi lisis tamponu ekleyin, sodyum orthovanadate içeren lysis tamponunun sadece PD-1-GFP-transfected hücreleri içeren plakalara eklenmesini sağlamak. Hemen kaldırmak ve plakalardan hücreleri toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Lysatları 1,5 mililitrelik soğuk tüplere aktarın ve 0,005 kat yerçekiminde ve 4 derecede 30 dakika döndürün.
Lysates'ten çekirdek sonrası süpernatant'ı toplamak için, 10,000 kat yerçekimi ve 4 santigrat derece 10 dakika boyunca aşağı çevirin. Supernatants yeni tüpler halinde aktarın ve pelet atın. Daha sonra WCL analizi için buz üzerinde altı plaka ikinci seti için supernatants saklayın.
Anti-GFP boncuklar hazırlamaya başlamak için, yavaşça yerleşmeönlemek için açmadan önce boncuk içeren şişe sallayın. Her koşulda bulamaç tan anti-GFP boncuk 40 mikrolitre çıkarın. 500 kat yerçekiminde santrifüj ve üç dakika boyunca dört santigrat derece.
Kaybı önlemek için pipet ve boncuk arasındaki teması en aza indirmek için emin olun, boncuk yıkamak için supernatant çıkarın. Örnek başına 80 mikrolitre likis tamponu boncukları yeniden askıya alın. Yıkanmış boncukları doğrudan dört plakalı ilk setin PD-1-GFP ifade eden hücrelerinden hücre lysate'sine ekleyin.
GFP etiketli proteinleri immünopprepititate etmek için 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca 0.005 kez yerçekimi nde döndürün. Her yıkama için ortovanadate içermeyen bir mililitre soğuk lysis tampon kullanarak boncukları üç kez yıkayın. Sonra 10 saniye boyunca 2,500 kat daha fazla yer çekiminde santrifüj.
Aktif SHP2'nin ilk plaka setinden üç eşit bölüme bölün ve yıkanmış PD-1-GFP içeren boncukları içeren üç tüpün her birine bir porsiyon ekleyin. Nontransfected hücrelerden yabani tip, PD-1-GFP boncukikinci tüp için lysate hacminin 1/3 ekleyin. Kalan 2/3'ü atın.
0.005 kez yerçekimi nazik rotasyon ile dört derece santigrat dört saat boyunca boncuk kuluçka. Bundan sonra, her yıkama için soğuk lysis tampon bir mililitre kullanarak iki kez boncuk yıkayın. Her numuneye 80 mikrolitre likis tamponu ekleyerek her tüpteki toplam hacmin 100 mikrolitre olmasını sağlar.
Bir kesme pipet ucu kullanarak, pipet yavaşça yukarı ve aşağı karıştırmak için. Daha sonra her tüpten 50 mikrolitreyi iki, taze, 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Fosfataz yıkama tampon ile bir kez boncuk yıkayın.
Sonra tamamen supernatant çıkarın. Boncuklara 100 mikrolitre arbede tamponu ekleyin ve nazik ajitasyon altında 30 dakika boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Tampon sarıya döndüğünde, sodyum hidroksit bir molar çözeltisi 50 mikrolitre ekleyerek reaksiyonu sona erdirin.
10 saniye boyunca 2, 500 kat yerçekiminde santrifüj. Bundan sonra, 96-iyi plaka yarım alanda iki kuyu içine supernatant aktarın. Emicileri 405 nanometrede okuyun ve pd-1-GFP'nin kontrol vahşi tipi sürümü üzerinde göreceli optik yoğunluk olarak sonuçları ifade edin.
Önce boncukları 2,000 kat yerçekiminde ve 4 santigrat derecede 30 saniye boyunca aşağı çevirin ve süpernatantı çıkarın. Iki kez Laemmli tampon 20 mikrolitre ekleyin ve beş dakika boyunca 95 santigrat derecede kaynatın. BCA kiti kullanarak, giriş kontrollerinin protein konsantrasyonu ölçün.
En seyreltilmiş numunenin 30 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın. Giriş kontrollerinin geri kalanını en seyreltilmiş numuneyle aynı konsantrasyonda seyreltmek için lysis tamponu kullanın. Daha sonra seyreltilmiş giriş kontrollerinin her birinin 30 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın.
Lysates iki kez Laemmli tampon eşit hacimlerde ekleyin ve beş dakika boyunca 95 derece santigrat kaynatın. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi Western Blot analizi yapmadan önce boncukları 2,000 kat yerçekimi ve 4 santigrat derece ile 30 saniye boyunca aşağı çevirin. Bu çalışmada, reseptör enzim etkileşimlerinin ve aktivasyonunun paralel değerlendirilmesi için kombine ko-immünopreksiyon ve enzimaktivitesi teşrisi geliştirilmiştir.
Beklendiği gibi, ITSM mutasyona uğratıldığında SHP2 PD-1'e bağlanmayı başaramadı. Dikkat çekici bir şekilde, ITIM'nin mutant versiyonu SHP2'nin sadece sınırlı bir ölçüde bağlanmasını engelledi. Bununla birlikte, SHP2-fosfataz aktivitesi titretisi, ITIM ve ITSM'nin enzimatik aktivite için eşit derecede vazgeçilmez olduğunu ortaya koymaktadır.
Bu, SHP2'nin dinlenme koşullarında otomatik olarak konformasyona katlandığı iki aşamalı bir aktivasyon modelini ortaya çıkarır. PD-1 aktivasyonu üzerine, SHP2 fosforile ITSM için işe alındı. Ancak, ITIM de aktif koformasyon içine SHP2 açığa fosforilted olmalıdır.
Gelişiminden sonra, bu teknik reseptör-enzim etkileşimlerinde protein etki fonksiyonlarının işlevini keşfetmek için hücre sinyalalanında araştırmacılar için önünü açabilir.
