该方法可以帮助回答细胞信号领域的关键问题，如不同蛋白质域在受体酶相互作用和酶激活中的重要性。该技术的主要优点是，它允许伴随测试受体酶相互作用和这种相互作用对酶活性的功能后果。对于每个板，使用10毫升DMEM，辅以10%FBS和1%青霉素和链霉素。
转染前一天，用血细胞计将人类胚胎肾293-T细胞种子放入12个10厘米的细胞中，以计算细胞数。在5°C的37摄氏度下孵育。一旦细胞是80-90%的汇合，使用基于脂质的转染剂转染五个板。
按照制造商关于 10 厘米板中粘附细胞的说明执行转染。然后转染相同的第二组五个板，以及一个额外的板，作为非递进的对照，用于在免疫沉淀前测量表达的蛋白质量。在 5%CO2 的组织中培养培养箱中孵育转染的板，48 小时。
使用荧光显微镜检查细胞的GFP表达，并确保转染成功发生。将 15 微升 100 毫摩尔正极钠与 50 微升 30% 过氧化氢混合，以准备新鲜的过氧化物混合物。要对PD-1的标记版本进行荧光化，请从PD-1-GFP转染细胞中去除介质。
在每个盘子中加入10毫升的普通DMEM和10微升的纯DMEM和10微升的纯DMEM和10微升的纯DMEM。在室温下在黑暗中孵育15分钟。在此之后，每次洗涤使用五毫升 PBS 在冰冷的 PBS 中三次清洗细胞。
在进行免疫沉淀时，所有步骤都应在冰上或在四摄氏度下执行。在10毫升缓冲液中溶解一片抑制剂，用蛋白酶抑制剂补充解解缓冲液。还要在用于PD-1-GFP转染板的缓冲液中加入一毫升正极酸钠。
向细胞中加入500微升的冰冷解液缓冲液，确保将含有正酸钠的开液缓冲液添加到仅含有PD-1-GFP转染细胞的板中。使用细胞刮刀立即从板中取出和收集细胞。将酸盐转移到1.5毫升的冷管中，并在重力0.005倍和4摄氏度下旋转30分钟。
为了从裂酸中收集后核上一提液，在10000倍的重力下旋转它们，在4摄氏度下旋转10分钟。将超自然剂转移到新管中并丢弃颗粒。将第二组六个板的超级钠存放在冰上，供以后进行WCL分析。
要开始准备防 GFP 珠子，请先轻轻摇动装有珠子的瓶子，以防止沉淀。每个情况从浆料中去除 40 微升的防 GFP 珠子。在500倍重力和4摄氏度的离心3分钟。
取出上流液清洗珠子，确保尽量减少移液器与珠子之间的接触，防止丢失。将珠子重新用 80 微升的解液缓冲液中重新填充。将洗涤的珠子直接从第一组四个板的PD-1-GFP表达细胞中加入细胞。
在 0.005 重力下旋转，在 4 摄氏度下旋转 30 分钟，以免疫沉淀 GFP 标记的蛋白质。使用一毫升冷解液缓冲液清洗珠子三次，每次洗涤时不含正交体。然后在2500倍重力下离心10秒。
将活性 SHP2 的 lysate 从第一组板中分成三个相等的部分，并在包含带洗涤 PD-1-GFP 的珠子的三个管中各加一部分。将非转染细胞的1/3的酸盐体积添加到野生型PD-1-GFP珠子的第二管中。丢弃剩余的 2/3。
在4摄氏度下孵育珠子4小时，在重力的0.005倍下轻轻旋转。在此之后，每次洗涤使用一毫升冷解液缓冲液洗珠子两次。在每个样品中加入80微升的解液缓冲液，确保每个管的总体积为100微升。
使用切割移液器尖端，移液器轻轻地向上和向下混合。然后将每个管中的50微升转移到两根新鲜1.5毫升的管子中。用磷酸酶洗涤缓冲液清洗珠子一次。
然后完全取出上一液。在珠子中加入100微升的检测缓冲液，在30摄氏度下在温和的搅拌下孵育30分钟。当缓冲液变黄时，通过加入50微升氢氧化钠的摩尔溶液来终止反应。
在重力2，500倍时离心10秒。在此之后，将上经器转移到一个96孔板中的两个半面积的井中。读取 405 纳米的吸水剂，将结果表示为 PD-1-GFP 控制野生型版本的相对光学密度。
首先在重力2000倍和4摄氏度的温度下旋转珠子30秒，然后取出上一液。加入20微升两次莱姆利缓冲液，在95摄氏度下煮沸5分钟。使用 BCA 试剂盒测量输入控件的蛋白质浓度。
将稀释量最大的样品的30微升转移到新管中。使用解液缓冲液将输入控制的其他控制装置稀释到与最稀释的样品相同的浓度。然后将每个稀释的输入控制装置的 30 微升转移到新管中。
将相等的体积为莱姆利缓冲液的两倍，煮95摄氏度，5分钟。在此之后，在执行文本协议中概述的西 Blot 分析之前，以 2000 倍的重力和 4 摄氏度旋转珠子 30 秒。在这项研究中，为受体酶相互作用和活化的并行评估，开发了联合免疫沉淀和酶活性测定。
毫不奇怪，当 ITSM 发生突变时，SHP2 未能绑定到 PD-1。值得注意的是，ITIM 的突变版本仅抑制了 SHP2 绑定的有限程度。然而，SHP2磷酸酶活性测定表明，ITIM和 ITSM对于酶活性同样不可或缺。
这揭示了一个两步激活模型，其中SHP2折叠成一个自动抑制的构象在休息条件下。PD-1 激活后，SHP2 被招募到磷酸化 ITSM 中。但是，ITIM 还必须进行磷酸化，以将 SHP2 展开到其活性构象中。
该技术发展后，可为细胞信号领域的研究人员探索蛋白质域在受体-酶相互作用中的功能铺平道路。
