يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إشارة الخلية مثل أهمية مجالات البروتين المختلفة في تفاعل إنزيم المستقبلات والتنشيط الأنزيمي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بإجراء اختبار متزامن لتفاعلات إنزيم المستقبلات والعواقب الوظيفية لهذا التفاعل على نشاط الإنزيم. لكل لوحة، استخدم 10 ملليلتر من DMEM تكملها 10٪ FBS و 1٪ البنسلين و ستريبتوميسين.
في اليوم السابق لتحول الدم، بذور الكلى الجنينية البشرية 293-T الخلايا في 12 10 لوحات 10 سم باستخدام مقياس الهيموسيتلتامتر لحساب الخلايا. احتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ C02. مرة واحدة في الخلايا هي 80 إلى 90٪ التقاء، واستخدام عامل تحويل الدهون على أساس نقل خمسة من لوحات.
تنفيذ transfection اتباع تعليمات الشركة المصنعة لخلايا الالتزام في لوحات 10 سم. ثم نقل مجموعة ثانية متطابقة من خمس لوحات جنبا إلى جنب مع لوحة إضافية واحدة بمثابة عنصر تحكم غير نقلة لقياس كمية البروتين أعرب قبل المناعة. احتضان اللوحات المصابة في حاضنة لثقافة الأنسجة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.
استخدام المجهر الفلورسنت لفحص الخلايا للتعبير GFP والتأكد من حدوث نقل بنجاح. مزيج 15 ميكرولترات من 100 ملليمولار الصوديوم orthovanadate مع 50 ميكرولترات من بيروكسيد الهيدروجين 30٪ لإعداد خليط pervanadate الطازجة. لفسفوريبليات الإصدارات الموسومة من PD-1، إزالة الوسائط من الخلايا المصابة PD-1-GFP.
إضافة 10 ملليلتر من DMEM عادي و 10 ميكرولترات من pervanadate إلى كل لوحة. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بغسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج PBS البارد بالجليد باستخدام خمسة ملليلترات من PBS لكل غسل.
أثناء إجراء المناعة، ينبغي أن يتم تنفيذ جميع الخطوات إما على الجليد أو في أربع درجات مئوية. تكملة العازلة تحلل مع مثبطات البروتياز عن طريق حل قرص واحد من مثبطات في 10 ملليلتر من العازلة. إضافة أيضا ملليمتر واحد من orthovanadate الصوديوم إلى المخزن المؤقت الذي سيتم استخدامه على لوحات PD-1-GFP-trans-fected.
إضافة 500 ميكرولترات من الجليد الباردة العازلة إلى الخلايا، مع التأكد من إضافة العازلة التحلل التي تحتوي على orthovanadate الصوديوم فقط إلى لوحات تحتوي على خلايا PD-1-GFP العابرة. استخدم مكشطة الخلايا لإزالة الخلايا وجمعها من اللوحات على الفور. نقل lysates في أنابيب باردة 1.5 ملليلتر وتدويرها في 0.005 مرة الجاذبية وعند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
لجمع ما بعد nuclei supernatant من lysates ، تدور عليهم في 10، 000 مرة الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. نقل اغطار في أنابيب جديدة والتخلص من بيليه. تخزين االصحون للحصول على المجموعة الثانية من ستة لوحات على الجليد لتحليل WCL في وقت لاحق.
للبدء في إعداد الخرز المضادة لـ GFP ، اصافح الزجاجة التي تحتوي على الخرز قبل الفتح لمنع الاستقرار. إزالة 40 ميكرولترات من الخرز المضادة لGFP من الطين لكل حالة. جهاز طرد مركزي في 500 مرة الجاذبية و 4 درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق.
إزالة supernatant لغسل الخرز، مع التأكد من تقليل الاتصال بين ماصة والخرز لمنع الخسارة. Resuspend الخرز في 80 ميكرولتررس من تحلل العازلة لكل عينة. إضافة الخرز غسلها مباشرة إلى الخلية lysate من الخلايا التي تعبر عن PD-1-GFP من المجموعة الأولى من أربع لوحات.
تدوير في 0.005 مرة الجاذبية لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية إلى المناعةcipitate البروتينات الموسومة GFP. غسل الخرز ثلاث مرات باستخدام ملليلتر واحد من عازلة التحلل الباردة التي لا تحتوي على orthovanadate لكل غسل. ثم الطرد المركزي في 2، 500 مرة الجاذبية لمدة 10 ثوان.
تقسيم lysate من SHP2 النشطة من المجموعة الأولى من لوحات إلى ثلاثة أجزاء متساوية وإضافة جزء إلى كل من الأنابيب الثلاثة التي تحتوي على الخرز PD-1-GFP غسلها. إضافة 3/1 من حجم lysate من الخلايا غير المُصابة إلى الأنبوب الثاني من نوع البرية، خرز PD-1-GFP. تجاهل 2/3 المتبقية.
احتضان الخرز لمدة أربع ساعات في أربع درجات مئوية مع تناوب لطيف في 0.005 مرات الجاذبية. بعد ذلك ، يغسل الخرز مرتين باستخدام ملليلتر واحد من عازلة التحلل الباردة لكل غسل. إضافة 80 ميكرولترات من عازلة التحلل إلى كل عينة، وضمان أن الحجم الإجمالي في كل أنبوب هو 100 ميكرولترات.
باستخدام طرف ماصة قطع، ماصة بلطف صعودا وهبوطا لخلط. ثم نقل 50 ميكروليتر من كل أنبوب إلى اثنين، الطازجة، أنابيب 1.5 ملليلتر. غسل الخرز مرة واحدة مع فسفاتز غسل العازلة.
ثم إزالة ناظر تماما. إضافة 100 ميكرولترات من العازلة المقايسة إلى الخرز واحتضان في 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تحت التحريض لطيف. عندما يتحول العازلة الصفراء، إنهاء التفاعل بإضافة 50 ميكرولترات من محلول واحد من الصوديوم هيدروكسيد.
جهاز طرد مركزي في 2،500 مرة الجاذبية لمدة 10 ثوان. بعد هذا، نقل المابير إلى بئرين من نصف منطقة في لوحة 96 جيدا. قراءة ماصة في 405 نانومتر والتعبير عن النتائج ككثافة بصرية نسبية على التحكم من النوع البرية نسخة من PD-1-GFP.
تدور أولا أسفل الخرز في 2، 000 مرة الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية وإزالة افرا. إضافة 20 ميكرولترات من مرتين Laemmli العازلة ويغلي في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. باستخدام مجموعة BCA، وقياس تركيز البروتين من عناصر التحكم في المدخلات.
نقل 30 ميكرولترات من العينة الأكثر المخفف إلى أنبوب جديد. استخدام المخزن المؤقت للتخفيف من بقية عناصر تحكم الإدخال إلى نفس تركيز العينة الأكثر المخفف. ثم نقل 30 ميكرولترات من كل من عناصر التحكم في المدخلات المخففة إلى أنبوب جديد.
إضافة وحدات التخزين متساوية من مرتين Laemmli العازلة إلى lysates ويغلي لهم 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد هذا، تدور أسفل الخرز في 2،000 مرة الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية قبل تنفيذ تحليل لطخة الغربية كما هو مبين في بروتوكول النص. في هذه الدراسة، تم تطوير تحليل مشترك للمناعة المشتركة والنشاط الأنزيمي للتقييم المتوازي لتفاعلات إنزيمات المستقبلات والتنشيط.
ومن غير المستغرب أن SHP2 فشل في الارتباط PD-1 عندما تم تحور ITSM. ومن اللافت للنظر أن النسخة المتحولة من ITIM منعت SHP2 من الربط فقط إلى حد محدود. ومع ذلك، فإن مؤشر SHP2-phosphatase النشاط يكشف أن ITIM و ITSM لا غنى عنها على قدم المساواة للنشاط الأنزيمي.
وهذا يكشف عن نموذج تفعيل من خطوتين حيث يتم طي SHP2 في التشكل autoinhied تحت ظروف الراحة. عند تفعيل PD-1، يتم تجنيد SHP2 إلى ITSM الفوسفورية. ومع ذلك، يجب أيضا أن يكون فسفور ITIM أن تتكشف SHP2 في التشكل النشط.
بعد تطورها، يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجال إشارات الخلايا لاستكشاف وظيفة مجالات البروتين في تفاعلات مستقبلات الإنزيم.
