当社のホモジメリックPROTACは、セレブロンの最初の化学阻害剤であり、サリドマイド類似体の分子機構をさらに解明し、セレブロンの生理学的機能を調べるのに役立つ可能性があります。この新しいPROTACプラットフォーム技術は、他の方法では追跡不可能と考えられている目的のタンパク質を特異的に標的化するのに非常に役立ちます。CRBN阻害だけでは抗腫瘍活性を有しない。
しかし、CRBN分解剤は、肥満、感染症、および他の障害に臨床的な影響を与える可能性があります。合成は困難であり、PROTAC化合物を設計する際に効果的なタンパク質分解剤を生成するための最適なリンカーとアタッチメントを見つけるのは難しいです。まず、ボック保護L-グルタミン2.46グラムとテトラヒドロフラン50ミリリットルを100ミリリットルの丸底フラスコに入れ、800rpmで1分間かき混ぜます。
次に、1.95グラムの1、1'カルボニルジミダゾール、触媒量の4-ピリジンを加えます。還流で10時間撹拌を続け、グルタリミド化合物の透明な無色溶液を得る。溶液を室温まで冷やし、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去する。
酢酸エチルの200ミリリットルで残渣を再溶解し、セパレーター漏斗に注ぎます。有機層を脱イオン水と塩水をそれぞれ50ミリリットルで洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させます。グリシカゲルを通して溶液を重力濾過し、乾燥剤を除去し、次いで200ミリリットルの酢酸エチルでシリカゲルをリンスする。
真空下で濾液から溶媒を除去し、無色固体として化合物1を得た。使用する前に、真空下で一晩乾燥させます。次に、0.50グラムの酢酸ナトリウムを20ミリリットルの氷酢酸に100ミリリットルのラウンドボトムフラスコに溶かします。
3-フルオロフタル無水物1.25グラムとグルタリミド1.14グラムを加え、還流で6時間かき混ぜて化合物3の紫色の溶液を得る。混合物を室温まで冷ましてから、100ミリリットルの脱イオン水に注ぎ、化合物3を沈殿させるために10分間かき混ぜます。ろ過して固体を回収し、水と石油エーテルで洗浄し、真空下で2日間乾燥させます。
次に、化合物3の0.83グラムと乾燥ジメチルスルホキシドの20ミリリットルを50ミリリットルのシュレンクフラスコに入れ、2分間かき混ぜます。アルファオメガジアミンリンカー化合物6の0.22グラム、N、N-ジイソプロピレチルアミンの1.05ミリリットルを加え、90°Cで18時間アルゴンの下で混合物をかき混ぜて、濃緑色の混合物でホモジマー8を得る。混合物を室温まで冷やし、100ミリリットルの脱イオン水に注ぎます。
酢酸エチルの3つの50ミリリットルの部分に製品を抽出し、有機層を組み合わせ、水と塩水のそれぞれ50ミリリットルでそれらを洗浄します。洗浄した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥剤を濾過し、真空下で溶媒を除去します。残渣を最小限のクロマトグラフィー溶媒に再溶解し、精製のためにシリカゲルカラムに塗布します。
蛍光生成物の分画を集め、それらを組み合わせ、溶媒を除去し、ホモモディマー8を黄色の固体として得る。まず、グルタリミド1の2.28グラムをジメチルホルムアミドの25ミリリットルに100ミリリットルの丸底フラスコに溶解する。この溶液中の粉砕炭酸カリウムの2.76グラムを中断します。
その後、20ゲージの針を備えた注射器に0.62ミリリットルのヨウドメタンを引き込みます。10秒間にわたってヨードメタンをドロップワイズ追加します。ゴム中隔でフラスコをストッパーし、ベント針を追加します。
混合物を室温で2時間超音波処理し、グルタリミド化合物2を得る。酢酸エチル50ミリリットルで混合物を希釈し、セパレーター漏斗に注ぎます。フラスコを酢酸エチルの別の50ミリリットルで漏斗にリンスします。
製品を製造し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、グルタリミド2を無色固体として得ます。グルタリミド化合物1および2の保持時間を比較し、N-メチル化が成功したことを確認した。検証を開始するには、多発性骨髄腫細胞を目的の化合物で処理します。
関連するタンパク質を分離し、タンパク質分解のウェスタンブロット分析用サンプルを調製します。次に、SDS-PAGE用のゲルサンドイッチを準備し、アノードバッファータンクにpH 8.9 tris-HCl溶液を充填します。タンパク質サンプルをゲルにロードし、70ボルトで20分間実行し、続いて115ボルトを150分間実行します。
次に、免疫ブロッティング用に1x転送バッファを調製し、ゲルをカセットから転写バッファーに慎重に移動して平衡化します。カセットからゲルを取り除くと、破裂して非常に迅速にくしゃくしゃになる可能性があるため、非常に注意する必要があります。0.45マイクロメートルのポリビニリデンジフルオリド膜を純粋なメタノールに少なくとも20秒間浸漬して活性化し、それを1x転送バッファに浸します。
ゲルと膜を10分間平衡させます。次いで、ウェスタンブロッティングカセットを組み立て、180ミアンペアを90分間塗布して、タンパク質を膜に移します。その後、免疫染色によりタンパク質を可視化する。
細胞生存率に及ぼす影響を評価するために、まず、生物学的三重化における96ウェルプレートのウェル当たり種子50,000多発性骨髄腫細胞。DMSOを含む培地の各ウェル100マイクロリットル、または化合物8、化合物9、またはポマリドミドの0.1、1、または10マイクロモルを加える。細胞生存率救助実験を行うために、代わりに、1つのマイクロモル溶液を加える前または後に、化合物8の100ナノモル溶液で細胞を3時間処理する。
5%の二酸化炭素雰囲気で24、48、または96時間摂氏37度で細胞をインキュベートし、発光アッセイで細胞の生存率を測定する。プロトンおよびカーボンNMRで同二量体PROTAC 8の構造を確認した。ヘテロ二量体PROTAC 9は、負の対照として合成され、グルタリミド部分内のN-メチル化として、セレブロン、またはCRBN、結合能の喪失をもたらす。
ホモPROTAC 8は、リンパ系転写因子IKZF1およびIKZF3に対する影響を最小限に抑え、完全なプロテオソームCRBN分解に近い誘導を行った。これに対し、ヘテロPROTAC9は、ポマリドミドと同様の挙動を示した。CRBN分解を誘導した化合物8は、プロテアソームの直接阻害剤によって遮断することができ、またはネチリル化阻害によって間接的に遮断される。
化合物8で前処理された細胞は、IKZF1およびIKZF3に対するポマリドミドの影響に有意に抵抗した。化合物8誘導CRBN分解は、化合物9およびポマリドミドからのIKZF1およびIKZF3分解よりも96時間後の多発性骨髄腫細胞生存率に対する影響のはるかに少なかった。化合物8で前処理された多発性骨髄腫細胞は、未治療細胞よりもポマリドミドに曝露した場合に有意に高い生存率を有し、化合物8が免疫調節性IMiD薬物耐性を模倣するために使用できることを示唆した。
化合物8は、セレブロンの完全なプロテアソーム分解を誘導し、IKZF1およびIKZF3細胞の生存率および増殖に副作用がないことを発見した。プロジェクト技術を他のターゲットに拡張することは、がんやその他の疾患に関連するタンパク質を不活性化し、追跡する可能性を秘めています。他の薬物やタンパク質にこの技術を適応させる場合は、薬物の分子構造とタンパク質標的を慎重に調査して、最適なリンカーと添付ファイルを選択する必要があります。
IMiDsはセレブロンの点突然変異のためにマウスでは機能しませんが、さらなる動物実験に使用できるトランスジェニックノックインマウスモデルが存在します。ポマリドマイドは、非常に催奇性である類似サリドマイドであるため、妊婦がこれらの薬物を使用することはお勧めしません。
