この方法は、性決定システムなどのハイメノプテラの分子生物学および遺伝的領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝的マッピングと分子状態に不可欠なアリボレンホビアエメリーの上に近親交配ラインを容易に誘導できることです。したがって、このミッションは、特定のアリの性決定システムに関する洞察を提供することができ、スズメバチなどの他のアリや他のヒメノプテラ種にも適用することができます。
プロトコルを開始するには、初夏の間にV.エメリのコロニーを収集します。収集した枝から、吸引器を使用して、ガラスカバー付きの人工石膏巣にアリの標本を移します。人工巣のコロニーを25°C、16〜8時間の明暗サイクルの下で維持する。
洗面ボトルを水道水に入れ、石膏を一日おきに一日おきに湿らせた状態に保ちます。次に、新しい生殖アリが出現するまで、1日おきに20マイクロリットルのチップを使用して、アルミニウム箔で包まれた乾燥したクリケットパウダーの約100マイクログラムと黒砂糖の水で満たされた先端をコロニーに追加します。畑からマイクロコロニーを収集し、新しい女王と男性を得るのに十分な食料を提供することが重要です。
まず、摂氏4度に設定された環境が15分間の部屋にコロニーを置くことによって、個人が移動するのを止めます。ステレオスコープの下で鉗子を使用して30個の作業アリの中足を取り除き、その後の近親交配十字架で生産された労働者からFゼロ世代を区別する。その後、交配十字架のための新しい小さな石膏の巣にアリを転送します。
次に、3~4匹の幼虫またはプーブを、作業員を含む石膏の巣に加えます。長い翼を持つ女王とオスを、交配十字架のために以前に準備された石膏の巣に移します。このステップでは、実験交差コロニーを通常のコロニーと同じ状態に維持することが重要である。
男性とメスを一緒に配置するだけで近親交配を誘導することは困難です。女王が翼を失い、卵を産むまで、食料と水を提供する16〜8時間の明るい暗いサイクルの下で25度のコロニーを保ちます。実験コロニーをステレオ顕微鏡で毎日確認してください。
F-1の子孫の間に近親交配の十字架を設定した後、卵はステレオスコープの下で観察することができる。F-oneクイーンが卵を産み始めた後、F-One世代とF-2世代が混合するのを防ぐために、巣からF-oneオスと幼虫またはプーブを取り除きます。F-2の子孫が出現するまで、コロニーを同じ条件で保ちます。
鉗子を使用してFゼロクイーンの片足を取り除きます。100マイクロリットルのチル剤を含む1.5ミリリットルマイクロチューブに脚を移します。ステレオスコープの下で鉗子を使用して超純水の300マイクロリットルで満たされたガラス皿の女性の腹部を解剖する。
交尾した男性の精子を含むスペルマティカを崩壊させる。スペルマティカの組織を剥がし、昆虫ピンを使用して女性の組織から精子を分離する。マイクロパイパッドを使用して、100マイクロリットルのチル剤を含む1.5ミリリットルマイクロチューブに精子を移す。
Fゼロクイーンと精子のサンプルを摂氏95度で20分間インキュベートします。フラッシュセントロはマイクロチューブを融合し、サンプルを摂氏4度で保存します。siv-mateF-oneクイーンによる卵の生産を確認した後、小屋の翼または1つの中足と遺伝子型を使用して女王のDNAを抽出する。
次に、片足をジェノタイピングしてF-One雄のDNAを抽出する。近親交配クロスからのオスアリの生殖能力を評価するために、鉗子を使用して400マイクロリットルのPBS溶液を含むガラス皿の内生殖器官を解剖する。その後、PBSを取り出し、マイクロパイパッドを使用して4%パラホルムアルジドに交換します。
PFAでサンプルを室温で40分間インキュベートして組織を固定します。固定後、マイクロパイパッドを使用して400マイクロリットルのPBSで組織を5回洗浄します。PBSで1ミリリットル当たり1ミリグラムにDAPI溶液を希釈.
PBSを取り除き、希釈したDAPI染色液を約300マイクロリットルを組織に加えます。暗い条件下で室温で15分間組織をインキュベートする。インキュベーションに続いて、400マイクロリットルのPBSで組織を5回洗浄し、鉗子を使用してガラススライドの中央に組織を移す。
次に、TRITCテトラメチルrhodaアミンを含む実装媒体に組織を取り付けます。最後に、20または60の3倍の対物レンズを使用して、共焦点レーザー走査顕微鏡でサンプルを観察します。ハプロイド男性対エメリの精巣の顕微鏡画像は、健康な線維組織を示さなかったディプロイド男性対エメリに存在しない健康な線維組織または精子を示す。
ディプロイド男性対エメリの男性生殖器官は精子を産生せず、精巣は発達せず、近親交配十字架で産生される男性は無菌であることを示唆している。その開発後、この技術は、私たちが速いタイミングアリ種のためにボレンホビアエメリで一定のセックスミカトニーを探求するための道を開きました。
