我々は、彼らの生物学を研究するために、深刻な害虫Tortrix塊を用いた大量飼育、観察および分子研究のための基本的、しかし非常に需要の高い大衆を提示する。これまでのところ、昆虫の卵の構造はさらなる分析を妨げている。特に、母体分泌物で覆われた薄くて柔らかく壊れやすい卵の研究を可能にしました。
トートリックスのさらなる研究、他の昆虫や他の分類群の試みに応用できると予想される簡単な技術があります。まず、女性1人と男性2人をパラフィン紙と一緒に120ミリリットルのプラスチックカップに入れて、マトララインを確立します。大量飼育用のおろし金を使って約60グラムの人工食をスライスします。
成熟した胚で満たされた卵塊をプラスチック容器内のスライスされた人工飼料の上に置く。スライスした食事と一緒に卵塊にパラフィン紙を置きます。15人の男性と10人の女性を25°Cで交配するためのプラスチック製の箱に入れます。
5〜7日ごとに卵を集め、世代ごとに大量飼育ステップを繰り返します。卵塊を1000マイクロリットルの1.2%次亜塩素酸ナトリウム水溶液に10分間または1000マイクロリットルの5モル水酸化カリウム水溶液に30分間浸して卵を分離する。分離した卵を1000マイクロリットルのPBStで洗浄する。
500マイクロリットルの100%ヘプタンおよび500マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドPBSt溶液の重量混合物に卵を浸す。ボルテックスミキサーを用いて毎分1500回転で10分間混合する。卵を500マイクロリットルの100%ヘプタンと500マイクロリットルの100%メタノールの混合物に浸す。
毎分1500回転で10分間混合する。卵を1000マイクロリットルの100%メタノールで2回洗い、100%メタノールで摂氏4度で保存します。卵を99%70%および50%エタノールおよびPBStにそれぞれ5分間順次浸して親水化させる。
卵をPBStで洗う.卵を1ミリリットルあたり1マイクログラムのDAPI溶液に5分間浸してから、PBSで卵を2回洗う。卵を20マイクロリットルの1.25%乳酸、酢酸またはCN溶液に浸し、核が鮮やかな赤色を示すまでヘテロクロマチンを視覚化する。
染色した卵をピペットでスライドガラスに移し、退色防止試薬とカバーガラスで封入した。鉗子を使用して卵塊からフェラーテ、アモマグネタマおよびアドキソフィエスホンマイ幼虫を抽出する。スライドガラス上の幼虫を解剖する。
100%メタノール中の1〜3個の99.7%禁欲酸の混合物で5分間組織を固定する。核が染色されるまで、1.25重量%重量%の乳酸溶液、禁欲溶液、またはCN溶液で染色する。顕微鏡下で女性のヘテロクロマチンの存在または男性の不在を観察することによって、各標本の性別を決定する。
性決定されたフェレート幼虫からDNAおよびRNAを抽出するには、性別決定された雄または雌の鉄酸幼虫12をプールし、細胞溶解緩衝液またはRNA抽出試薬のいずれかを1本の1.5ミリリットルチューブに加える。固定、透過処理、染色のステップにより、DAPI溶液による核の可視化が可能になります。解剖されたフェレート幼虫を用いた乳酸、禁欲的またはCN染色は、雌はヘテロクロマチンを点として示すが、雄はヘテロクロマチンを欠いていることが明らかになった。
スピンカラムを用いた改変されたプロトコルは、260~200の比率が1.9~2.1、260~280の比率が1.9~2.3の900~1500ナノグラムの産物を産生するRNAの品質を改善した。改変されたプロトコルのRNA濃度比は1.2未満であり、次世代シーケンシングの品質要件を満たしていました。改変プロトコールを用いて性決定されたフェレート幼虫から抽出されたRNAの無傷性を、マイクロチップ電気泳動を用いて確認した。
調製したライブラリーは、高いQ30スコア読み取りを生じることを確認した。私たちのメッセージは、基本的な昆虫研究と害虫ツールに貢献しています。さらに、我々のプロトコルは、胚発生中に効果的な化学農薬または細胞間微生物を評価するために使用される可能性がある。
