ひなのサイズと胚の生存率を決定するためのこのプロトコルは、多くのC.elegansラボで使用されています。ブルートサイズと胚の生存率の低下は、筋症、受精、胚形成などの重要な発生過程の欠陥を示している可能性があります。この手法は、初心者のC.elegans研究者に明確な指示を提供します。
セットアップと実行は比較的簡単で、新しい変異株を扱う際の優れた出発点です。この技術の最大の課題は、胚と未受精の胚の識別です。新しい研究者は、これらの実験を開始する前に、胚、卵母細胞、およびさまざまな幼虫期の識別を練習する必要があります。
まず、プレートの裏側にラベルを付け、個々のL4ステージ雌雄同体をプレートに移します。胚や他のワームがプレートに移されていないことを確認してください。ワームが成虫に成長し、摂氏20度の標準培養温度で24時間自己子孫を産むのを待ちます。
3日目にプレートを採点します。翌日、新しいプレートのセットにラベルを付け、1日目の個々のワームを新しいプレートに移します。ワームが摂氏20度で24時間胚を産むのを待ちます。
4日目にプレートを獲得します。3日目に、新しいプレートのセットにラベルを付け、2日目の個々のワームを新しいプレートに移します。ワームが20度で24時間子孫を産むのを待ちます。
5日目にプレートを採点します。細かいマーカーを使用して、35ミリメートルの蓋にグリッドパターンを描きます。以前にカウントされたワームを追跡するために、カウントのためにテストプレートの下にグリッド状の蓋を置きます。
差動セルカウンターを使用して、個々の正方形内の生きている幼虫と孵化していない胚を数えます。四角い境界線上のワームの場合、ワームヘッドの位置に基づいてカウントします。頭が正方形の上端と左端に触れているワームを数えます。
生きた幼虫と孵化していない胚の数を実験ノートに記録します。4日目に、生きている幼虫と孵化していない胚を数えて2日目のプレートを採点し、実験ノートに記録します。5日目に、生きた幼虫と孵化していない胚を数えて3日目のプレートを採点し、実験ノートに記録します。
プレートの裏側にラベルを付けた後、個々のL4雌雄同体のワームをプレートに移します。胚や他のワームがプレートに移されていないことを確認してください。単一のL4オスワームをL4雌雄同体を含むプレートに移します。
ワームが摂氏20度で24時間交尾して子孫を産むのを待ちます。3日目に生きた幼虫と孵化していない胚のプレートをスコアリングします。翌日、新しいプレートのセットにラベルを付け、雌雄同体と男性を新しいプレートに移します。
雌雄同体が成人期に達したことを確認してください。雌雄同体が摂氏20度で24時間子孫を産むのを許します。4日目に生きた幼虫と孵化していない胚のプレートをスコアリングします。
3日目に、新しいプレートのセットにラベルを付け、雌雄同体と男性を新しいプレートに移します。ワームが20度で24時間子孫を産むのを待ちます。5日目に生きている胚と孵化していない胚のプレートをスコアリングします。
差動セルカウンターを使用して、1日目の生きた幼虫と孵化していない胚を数え、実験ノートに記録します。4日目に、2日目のプレートから生きている子孫と孵化していない胚を数え、実験ノートに記録します。男性の1日目のプレートを確認してください。
交配が起こった場合、男性に対する雌雄同体の予想される遺伝的比率は50対50です。1日目に男性が含まれていない場合、男性と雌雄同体の間の交配は発生しませんでした。この交配ペアを破棄し、観察結果を実験ノートに記録します。
5日目に、3日目のプレートから生きた幼虫と孵化していない胚を数え、実験ノートに記録します。N2の胚生存率アッセイでは98.9%の生存率が得られましたが、him-5(e1490)とspo-11(ok79)はどちらもそれぞれ74.9%と0.8%の割合で胚生存率の低下を示しました。N2, him-5(e1490)およびspo-11(ok79)の平均ひなサイズは、それぞれ217、105および219であると決定された。
C.elegansの開発のさまざまな段階を認識することは、正確で再現性のあるデータにとって重要です。写真と解剖顕微鏡を使用してワームの開発に精通することをお勧めします。この手順は、遺伝子が発生過程に関与しているかどうかを判断するための優れた最初のステップであり、どの過程が中断されているかを判断するための細胞学的分析が続く可能性があります。
