ヒトの細胞タイプにLDLコレステロール取り込みの実画像解析方法を紹介する。これは、化合物をスクリーニングすることができます, LDLコレステロールの輸送を変更します.LDL流入定量のために生細胞イメージングを使用する主な利点は、アッセイ期間を通じて細胞形態を監視することができるため、潜在的に有毒化合物を検出できることである。
まず、以前に調製した細胞から培地を吸引し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水を5ミリリットルで洗浄する。DPDSを吸引する。次に、100ミリメートル皿から細胞を取り外し、HepG2細胞に0.25%トリプシン-EDTAの1.5ミリリットルを加え、HK2細胞またはHCAECに0.05%トリプシン-EDTA溶液の1.5ミリリットルを加えます。
プレートを摂氏37度で4分間インキュベートします。その後、HepG2およびHCAEC細胞に対して3ミリリットルの完全な培地を添加してトリプシンを中和する。トリプシン中和溶液の3ミリリットルを使用し、HK2細胞の5%のウシ胎児血清またはFBSでDPDSを妥協する。
細胞を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、250gで5分間遠心分離する。スピン後、培地を吸引し、完全培地中の細胞ペレットを再懸濁する。40ミクロンのメッシュストレーナーを通して細胞の懸濁液をそっと濾過し、細胞の塊を分解します。
細胞を数え、24ウェルプレートに最適化された密度でプレートします。細胞が付着できるように、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、細胞株のFBSなしのベース培地に細胞培地を変更し、5%リポタンパク質欠損血清、または2%FBS培地を加えた。
24ウェルプレートでウェルあたり500マイクロリットルの合計培地を使用してください。その後、細胞を飢えさせるために24時間インキュベーションを続けます。飢餓ステップまたは翌日に加えて、細胞は所望の化合物および適切なコントロールで処理され得る。
飢餓の24時間後、500マイクロリットルの培地を含む各ウェルに5マイクロリットルのpHrodo赤色標識LDLを加え、1ミリリットル当たり10マイクログラムの最終濃度を得る。慎重に井戸から任意の泡を削除します。標識されたLDLを添加した直後に、プレートを生細胞分析システムインキュベーターに入れ、プレートを平衡化させてプレート内の縮合を低減します。
細胞がインキュベートしている間、ソフトウェアを開き、プレートを保持する容器を追加してスキャンをスケジュールします。ウェルあたり画像16画像は、赤と位相チャネルを使用して4時間の10倍の倍率で1時間間隔を追加します。次に、データ処理に使用するプレート マップを作成し、[プロパティ] タブを選択してプレート マップを選択します。
セルタブにセルタイプを入力し、複合タップで処理します。次に、[リージョン] タブをクリックし、各レプリケート セットを選択してリージョンを割り当てます。実験実行が完了したら、ソフトウェアにイメージセットを作成し、カウントセットに含まれる各パラメータを定量化するようにコンピュータをトレーニングします。
ソフトウェアでプレートビューを開き、分析ジョブユーティリティボックスで[イメージコレクションを作成]または[イメージコレクションに追加]を選択します。新しいイメージ コレクションを選択し、イメージ コレクションの名前を入力し、チャンネルの横にあるチェックボックスをオンにして、赤と位相のチャネルを選択します。異なるウェルとタイム ポイントからさらに 5 つのイメージを選択し、現在のイメージ コレクションに追加してイメージ コレクションに追加します。
[分析ジョブ ユーティリティ] ボックスで、新しい処理定義を選択し、ドロップダウン メニューからイメージ コレクションを選択し、セルの種類のパラメーターを入力します。プレビュー ボックスで、ドロップダウン メニューを使用して[すべてプレビュー]を選択します。解析マスクボックスで、コンフルエンスマスクと赤のオブジェクトマスクボックスをオンにして、処理定義の解析に含まれる領域を表示します。
イメージ コレクションをスクロールして、セルと LDL がマスクに含まれていることを確認します。ファイルを選択し、処理定義を保存します。次に、実験プレートビューを開き、実験実行からの一連の画像を解析する。
分析ジョブユーティリティボックスで、新しい分析ジョブを起動を選択し、保存された処理定義を選択します。解析ジョブに名前を付け、分析の時間範囲を選択し、分析する実験井戸を強調表示します。起動ボタンを選択します。
分析ジョブが完了したら、データをエクスポートし、完了した分析を選択してビューを押します。ユーティリティメニューで、メトリックグラフのエクスポートを選択します。領域メニューで、すべてのウェルを選択し、グループメニューで、グループとしてのウェルの各セットの平均値を取得するには、反復を選択します。
各ウェルの個別値をエクスポートする場合は、[なし] を選択します。赤のオブジェクトメトリックメニューで、赤オブジェクトの合計の統合強度を選択します。データエクスポートボタンを選択します。
データを個々の画像に分割するチェックをします。データはクリップボードに自動的にコピーされ、新しいスプレッドシート ファイルに貼り付けることができます。フェーズ オブジェクト メトリック メニューで、合流を選択し、データ エクスポート ボタンをクリックします。
プロンプトタブで、データを個々の画像に分割するを確認します。データはクリップボードに自動的にコピーされ、合計赤オブジェクトの統合強度データを含むスプレッドシートファイルに貼り付けることができます。これで、エクスポートされたデータは、プロトコルのステップ 4.1.7 および 4.1.8 に従って正規化され、最終的な LDL 取り込み値を取得できます。
ダイナソーレまたは組換えPCSK9による治療後、3つの試験されたヒト細胞株すべてが、4時間のタイムコースにわたってLDL流入の有意な減少を示した。LDL流入は、ヒト肝癌またはHepG2細胞において減少し、ダイナソーレの治療を経て、DMSOをコントロールとして処理した細胞と比較した。異なる時点でのHepG2細胞におけるLDL流入の生細胞イメージングは、LDL流入における有意な変化を検出するためにこの方法の感度を支持するシンバスタチンによる治療後のLDL取り込みの市場増加を示した。
初期時点および最終終点で調査したリアルタイム画像は、ダイナソーレ処理後の細胞の正常形態を確認し、この化合物の有効性および安全性を示す。さらに赤色標識されたLDLを細胞に加えて蛍光活性を維持した後、ライブセルイメージングシステムインキュベーターに入れるまでプレートを光から保護することが重要です。異なる器官からの細胞は、治療に異なる反応を及びることができ、反対方向を意味し、同じ方向に応答するが、コレステロール取り込みにおける異なる変化率を示す。
生細胞イメージングでのみ、このような差異を検出し、正確に定量することができる。
