我々のプロトコルは、科学者が個々の上皮細胞の細胞下アトミオシンネットワークを分析するのに役立ち、また、湾曲した上皮組織の多細胞スケールで同様の分析を行うことを可能にする。私たちのプロトコルは、フィジーのアプリケーションの素晴らしい例です。直感的なグラフィカルユーザーインターフェイスを備えており、スクリプトの知識は必要ありません。
そのため、初心者の現場にも最適です。我々の方法はショウジョウバエ卵室のために開発されたが、それはまた、ショウジョウバエ上皮の外に適用可能である。私たちは、科学者がモデルシステムで私たちのプロトコルをテストすることを奨励します。
このプロトコルを理解するには、付属のテスト ファイルを使用します。このプロトコルのどの部分が個々の研究の質問に適するかを決定するのに役立ちます。このプロトコルのこの部分は、ユーザーがタイムラプスムービーで上皮細胞をセグメント化し、その後、Surface Managerを使用して個々の細胞内のアクトミオシンパルスを時間をかけて分析することを可能にする。
まず、フィジーを開き、マクロのティッシュセルセグメントムービーをインポートします。付属のテキストプロトコルに記載されている ijm。次に、漂白剤補正した TIFF ファイルを開き、メニュー バーに移動して[イメージ]、[色]、および [分割チャネル] の順に選択して、漂白剤補正ファイルのチャンネルを分割します。
選択したタイムラプスムービーのアクティブセル膜チャンネルで、開いているスクリプトでアイコンをクリックして、アップロードしたスクリプトを実行します。優れたセル マスクを取得するには、ガウス ブラーを 2.500 に設定し、セル検出感度をマイナス 1 に設定し、[OK] をクリックします。次に、63x の目的で取得したタイムラプス ムービーの推定ノイズ許容値を 10 ~ 20 の範囲で設定し、[OK] をクリックします。生成されたセルマスクが、解析されたタイムラプスムービーに表示され、ParticleStack という新しいウィンドウが表示され、「アクションが必要」という小さなウィンドウも表示されます。タイムラプスムービーのセルマスクから、中央のセルだけに焦点を当て、タイムラプスムービー全体を通して完全かつ明確に定義されたアウトラインを提供できるセルを選択します。
中央の選択したセルが実際のセル膜にうまく対応している場合は、ParticleStack を TIFF ファイルとして保存します。フィジーで対応するパーティクルスタック TIFF ファイルを開きます。フィジーにインストールされている Surface マネージャープラグインで、プラグインを開きます。
Surface Manager で、[アウトライン イメージを読み取り] ボタンをクリックし、セルの数によっては、ジャックカード インデックスを 60% に設定すると、アウトラインの読み込みに数分かかる場合があります。ロード後、各セルに S 番号が割り当てられ、サーフェス マネージャ ウィンドウの左側に表示されます。選択した S 番号をクリックして、ParticleStack1 から読み込んだセルのアウトラインを作成します。
ティフはタイムラプス映画に登場します。ムービー全体で、インポートされた各 S 番号のセルのアウトライン品質を確認し、誤ったセルのアウトラインを表示する不要なセルを削除します。不要なセルを削除するには、セルのアウトラインをハイライト表示して[削除]ボタンをクリックします。
ブラシツールを使用して、セルのアウトラインを修正します。完了したら、修正したセルを RoiSet として保存します。zip ファイル。
分析された組織にアクトミオシンパルスが存在するかどうかを特定し、詳細な行動を理解する, だけでなく、アトミオシン信号の方向性, フィジーを開くことから始めます.タイムラプスムービーを開き、保存されたParticleStack1をロードします。ティフセルマスクと漂白補正されたタイムラプスムービーを読み込み、その後、Surface Managerプラグインと関連する領域をRoiSetからロードします。
zip ファイル。次に、Surface Manager で、目的のシグナルを持つチャネルをアクティブにします。[統計] ボタンをクリックして、[スライスによる平均グレー値スライス] というウィンドウを取得します。
アクトミオシン信号の平均と中央値の強度は、時間の経過とともに、セルの面積と形状に関連する他のパラメータとして表示されます。[統計] ウィンドウに移動し、[ファイル] をクリックして [名前を付けて保存] を選択し、セル マスクを生成して Surface Manager にロードして、組織スケールでアクトミオシン パルスを解析して、値をスプレッドシート ファイルとして保存します。プロトコルのこの部分は、ユーザーが選択的に時間をかけて湾曲上皮組織中のアクトミオシンの薄い層を抽出することができます.
これらの手順は、ユーザーフレンドリーで、直感的なグラフィカルインターフェイスに基づいています。フィジーを開き、楕円面投影プラグインがインストールされていることを確認します。次に、タイムラプスムービーを開き、プラグインをクリックして、BigDataViewerに移動し、XML/HDF5ファイルとして現在のイメージをエクスポートを選択して、XML /HDF5ファイルとしてエクスポートします。
次に、エクスポートしたファイルを[Ellipsoidサーフェスプロジェクション]で開くには、プラグインに移動し、BigDataViewerをクリックし、続いて楕円体表面投影を選択し、XMLファイルを選択します。これにより、卵室の矢状のビューを持つ新しいウィンドウが開き、処理を通してユーザーを導くダイアログが表示されます。「卵巣投影」と呼ばれるダイアログウィンドウには、いくつかのタブがあります。
バウンディングボックスと呼ばれる最初のダイアログタブで、バウンディングボックスのz幅と共にタイムラプスムービー内の卵室のxとYの境界線を定義し、セットを押します。卵の部屋の選択された部分はピンクで強調される。次に、ダイアログ タブでシグナル BLOB のサイズを定義する、オポレの投影ウィンドウで blob を検索します。
シグマと最小ピーク値を定義します。次に、計算を押して、緑色のブロブとして表示されるアクトミオシン信号を識別します。約 100 個のスポットが見つかるまで、異なるパラメーターでこの手順を再試行します。
アクトミオシンシグナルを同定することは重要なステップです。信号の品質と検出された BLOB の正しいサイズによって異なります。画像に表示されている緑色のスポットがない場合、次のステップは機能しません。
楕円体をデザインするには、fit エリプソイドと呼ばれるタブを続けます。ランダムサンプルを 10,000、外側/内側のカットオフ距離を 1 ~ 10 に設定し、[計算] をクリックします。この後、投影と呼ばれるタブが自動的に開き、サーフェス抽出の定義が可能になります。
投影タブで、希望の楕円体の幅として最小投影距離と最大投影距離を設定します。ピンクの定義された楕円体領域が卵室の外側の層全体を含むので、最小および最大の投影距離が収まる必要があります。次に、スライスの距離を 1 として定義します。
卵の部屋で定義された楕円体のピンク色の領域が計算を押す前に見えるようにしてください。これは、新しい楕円体フィットの品質を評価するのに役立ちます。次に、楕円体の出力幅を 800 以上、高さが 400 以上に設定します。
次に、サーフェス抽出の継続時間を設定し、球状または円筒状の投影法のいずれかを選択します。必要に応じて、Z を反転して Y.Press 計算を調整し、イメージと呼ばれる新しいウィンドウで両方のチャネルのサーフェス抽出を取得します。画像をクリックし、[調整]に進み、[明るさ/コントラスト]を選択して、得られた画像ウィンドウの明るさとコントラストを調整して、投影されたアキトミオシン信号を確認できます。
サーフェスの抽出が良好な場合は、両方のチャネルを TIFF ファイルとして別々に保存します。さらに、この特定の卵室の表面がどのように抽出されたかについて、将来の参照のためにログウィンドウファイルを保存します。次に、フィジーで優先カラー コードを使用してチャネルをマージし、結果を TIFF ファイルとして保存します。
このプロトコルは、上皮組織におけるアクトミオシンネットワークの挙動を調査することを可能にする。これは、局所細胞スケールでのアクトミオシン挙動の詳細な分析が組織スケールで同様の分析と組み合わされた場合にのみ可能である。ここに示されているのは、局所細胞スケールおよび対照および脂肪2変異体ショウジョウバエ卵室のための組織スケールにおける動的ミオシンII挙動の代表的な例である。
基底単面では、ミオシンII信号の緑色の調節軽鎖は、コントロール卵室の前後軸に垂直に移動します。この極性は、脂肪2変異卵室で失われ、異方性ミオシンIIパルス、組織レベルでの振動、コントロールサンプル中のミオシンIIの緑色改変調節軽鎖は、上皮回転を促進するために必要な同期力を生成する。対照的に、fat2変異卵室の卵胞上皮は基底側で強く脈拍を起こすので、上皮回転を促進するために必要な同期力を生じに失敗する。
ショウジョウバエ卵室の薄い有端領域では、fat2変異体はまた、ミオシンII.の緑色修飾調節軽鎖の変化した動的挙動を提示する。このビデオを見た後、あなたはフィジーを使用してショウジョウバエ卵室の局所および組織スケールでアトミオシンネットワークを分析する方法の良いアイデアを持っているはずです。実用的なヒントとトラブルシューティングについては、プロトコルの後の説明部分を参照してください。フィジーやプラグインに関するご質問は、それぞれのウェブページをご覧いただくか、当社までお問い合わせください。
