Ce protocole fournit un moyen rapide d’évaluer les effets de l’élimination du gène WC5, qui est la cause la plus fréquente d’épilepsie focale. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons l’utiliser pour évaluer l’épilepsie, comme le phénotype en utilisant à la fois des caractéristiques comportementales et physiologiques à différents stades de développement. Un jour avant la micro-injection, installez les réservoirs d’accouplement Zebrafish.
Le matin de l’injection, retirez les séparateurs pour permettre le frai. Utilisez un tamis fin pour transférer les œufs dans des boîtes de Petri de 100 millimètres, remplies d’eau embryonnaire. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, choisissez 60 à 80 œufs et disposez les œufs dans une boîte de Petri enduite de silicone pour l’injection.
nous déplaçons la majeure partie de l’eau, en laissant juste assez pour couvrir les œufs à mi-chemin. Placez une aiguille de verre verticalement dans un tube de solution injectable. Laissez la solution colorée remplir le tube par action capillaire sur une période de plusieurs minutes.
Lorsque la solution injectable est visible à l’extrémité de l’aiguille, montez l’aiguille sur la poignée d’injection du micro-injecteur et allumez le compresseur d’air. Ajustez le réglage de la pression pour générer un volume d’injection de deux nanolitres. Et de placer les œufs sous un microscope binoculaire disséquant, avec un grossissement de quatre fois.
Insérez la pointe de l’aiguille à travers le chorion et le jaune des embryons à un stade pour injecter la solution directement dans chaque cellule. Ensuite, transférez les embryons injectés dans une boîte de Petri étiquetée de 100 millimètres d’eau embryonnaire et placez la plaque dans un incubateur de 28 degrés Celsius. 28 heures après la fertilisation, placez une grille en plastique de 1,2 par 1,2 millimètre au fond du plat d’essai.
Utilisez une pipette Pasteur en plastique pour placer 10 à 12 embryons dans leurs chorions sur la maille en plastique. Remplissez le plat avec suffisamment d’eau embryonnaire pour garder l’embryon submergé, mais pas flottant, en déplaçant soigneusement les embryons avec une pointe en plastique en position sur la grille si nécessaire. Ensuite, à l’aide d’une caméra vidéo fixée à un microscope à dissection, enregistrez l’activité d’enroulement spontanée pendant 10 à 20 minutes.
Pour analyser le mouvement spontané total, utilisez le module de quantification de l’activité dans un système de laboratoire Zebra pour télécharger la vidéo enregistrée et concevoir les arènes de suivi autour de chaque embryon, le cas échéant. Réglez les seuils de gel et d’éclatement sur 10 et 50 respectivement. Et lors de l’analyse vidéo automatisée, qui quantifie l’activité totale à l’intérieur de chacune des arènes définies.
Ensuite, récupérez l’ensemble de données sous forme de feuille de calcul pour effectuer l’analyse, à l’aide du logiciel d’analyse de données approprié. 46 heures après la fécondation, utilisez des pinces fines pour déséchorioner les embryons et remplissez un plat d’essai de 130 millimètres avec de l’eau embryonnaire. Au moins 15 minutes avant le repos, réchauffer le plat d’essai dans un incubateur à 28 degrés Celsius.
Pour effectuer un test de réponse d’échappement évoqué au toucher, utilisez une pipette Pasteur en plastique pour placer un embryon au centre de la boîte de test, sous la caméra. Commencez l’enregistrement en utilisant un taux d’acquisition de 30 images par seconde. À l’aide d’une fine pointe en plastique, touchez légèrement la queue de l’embryon avec un mouvement de scintillement.
Arrêt de l’enregistrement, lorsque la larve a terminé son mouvement. Ensuite, transférez l’embryon dans un nouveau plat rempli d’eau fraîche et répétez le test avec autant d’embryons que nécessaire pour chaque condition expérimentale. Pour préparer le poisson zèbre à l’analyse électrophysiologique, placez un, quatre à six jours après la fécondation du poisson dans une boîte de Petri à fond de verre.
Enlevez tout excès de milieu marin supplémentaire pour vous assurer que le poisson sera aussi près que possible du fond du plat. Utilisez une pipette pasteur en plastique pour ajouter suffisamment d’agros liquides chauds pour couvrir la larve. Pendant que les agros hardnes, utilisez des pinces fines pour orienter le côté ventral du poisson vers le bas au centre du plat.
Ajoutez ensuite deux millilitres de solution d’enregistrement, contenant 10 bromure de pancuronium micromolaire à la boîte pour bloquer la transmission neuromusculaire. Ensuite, remplissez un micropipetting avec une solution d’enregistrement et utilisez un amplificateur de pince de patch dans la configuration de la pince de tension pour mesurer la résistance de l’électrode dans le bain afin de confirmer sa valeur correcte. À l’aide d’un objectif 20x, positionnez la tête de la larve dans le champ de vision central et abaissez le micropipet pour atteindre la position d’enregistrement dans le tectum optique.
basculez l’amplificateur de pince de patch sur la configuration de pince actuelle et fixez le courant de maintien à zéro milliampère. À l’aide d’un filtre passe-bas d’un kilohertz, d’un taux d’acquisition d’un kilohertz et d’un gain numérique de 10, enregistrez l’activité spontanée du poisson pendant 60 minutes pour déterminer les niveaux d’activité de base. À la fin de l’enregistrement de base, à 143 microlitres d’une solution de 300 millimolaires par litre de pentylènetétrazole au bain, pour une concentration finale de 20 millimolaires par litre.
Enregistrer l’activité neuronale de l’animal dans une solution de pentylènetétrazole pendant encore 120 minutes. Au cours de la période de référence de l’enregistrement, quatre à six jours après la fécondation, les modèles épileptiques de poisson zèbre montrent une fréquence plus élevée d’événements spontanés, tandis que les poissons témoins d’inadéquation présentent très peu de fluctuations. Après l’application du ptélylènetétrazole, les modèles de contrôle de l’inadéquation et d’épilepsie du poisson zèbre présentent un nombre accru d’événements de polarisation profonde.
Au cours de la première période suivant l’application du ptélylènetétrazole, un taux de 0,8 événement par minute est observé à la fois chez les animaux témoins et abattements pour lesquels la majorité des événements sont d’une grande amplitude. Au cours de cette dernière période de réponse. Le taux d’événements de dépolarisation augmente à environ un événement par minute.
Et la majorité des événements sont de faible amplitude. Lors de l’exécution de knock down, il est très important d’établir la dose correcte de morpholinos à l’aide d’une courbe dose-réponse et d’effectuer des contrôles pour éviter les toxicités non spécifiques. Cette poussée pour permettre plusieurs études en aval, y compris le test des effets des modificateurs génétiques ou chimiques.
Et le comportement du poisson-zèbre et l’activité neuronale pour comprendre les effets sur le développement des cinq mutations DC.
