Этот протокол обеспечивает быстрый способ оценки последствий сбивания гена WC5, который является наиболее распространенной причиной фокальной эпилепсии. Основным преимуществом этой методики является то, что мы можем использовать ее для оценки эпилепсии, как фенотипа, используя как поведенческие, так и физиологические особенности на различных стадиях развития. За день до микроуколажа установите брачные резервуары для рыбок данио.
Утром после инъекции удалите разделители, чтобы включить нерест. Используйте тонкое сито для переноса яиц в 100-миллиметровые чашки Петри, наполненные эмбриональной водой. Используя пластиковую пипетку Пастера, соберите от 60 до 80 яиц и разложите яйца в силиконовой чашке Петри для инъекции.
мы перемещаем большую часть воды, оставляя ровно настолько, чтобы покрыть яйца наполовину. Поместите стеклянную иглу вертикально в трубку с раствором для инъекций. Дайте цветной раствору заполнить тюбик капиллярным действием в течение нескольких минут.
Когда раствор для инъекций будет виден в кончике иглы, установите иглу на инъекционную ручку микроинжектора и включите воздушный компрессор. Отрегулируйте настройку давления, чтобы создать объем впрыска в два нанолиттера. И поместить яйца под рассекающий бинокулярный микроскоп, с четырехкратным увеличением.
Вставьте кончик иглы через хорион и желток одностадовых эмбрионов, чтобы ввести раствор непосредственно в каждую клетку. Затем перенесите введенные эмбрионы в меченую 100-миллиметровую чашку Петри с эмбриональной водой и поместите пластину в инкубатор с 28 градусами Цельсия. Через 28 часов после внесения удобрений поместите пластиковую сетку 1,2 на 1,2 миллиметра на дно тестовой посуды.
Используйте пластиковую пипетку Пастера, чтобы поместить от 10 до 12 эмбрионов в их хорионах на пластиковую сетку. Наполните тарелку достаточным количеством эмбриональной воды, чтобы держать эмбрион погруженным, но не плавающим, осторожно перемещая эмбрионы пластиковым наконечником в положение на сетке по мере необходимости. Затем, используя видеокамеру, прикрепленную к микроскопу рассечения, запишите спонтанную активность накатки в течение 10-20 минут.
Чтобы проанализировать общее спонтанное движение, используйте модуль количественной оценки активности в лабораторной системе Zebra, чтобы загрузить записанное видео и спроектировать арены отслеживания вокруг каждого эмбриона по мере необходимости. Установите пороговые значения заморозки и разрыва на 10 и 50 соответственно. И при автоматизированном видеоанализе, который количественно оценивает общую активность внутри каждой из определенных арен.
Затем восстановите набор данных в виде электронной таблицы для выполнения анализа, используя соответствующее программное обеспечение для анализа данных. Через 46 часов после оплодотворения используйте тонкие щипцы для дехорионизации эмбрионов и наполните 130-миллиметровую тестовую чашку эмбриональной водой. По крайней мере, за 15 минут до отдыха разогреть тестовую посуду в инкубаторе с 28 градусами Цельсия.
Чтобы выполнить тест на побег с помощью прикосновения, используйте пластиковую пипетку Пастера, чтобы поместить эмбрион в центр тестовой чашки под камеру. Начните запись, используя скорость захвата 30 кадров в секунду. Используя тонкий пластиковый наконечник, слегка коснитесь хвоста эмбриона мигающим движением.
Остановка записи, когда личинка прекращает свое движение. Затем перенесите эмбрион в новую чашку, наполненную свежей эмбриональной водой, и повторите тест с таким количеством эмбрионов, сколько необходимо для каждого экспериментального состояния. Чтобы подготовить рыбу зебры к электрофизиологическому анализу, поместите рыбу через один, четыре-шесть дней после оплодотворения в чашку Петри со стеклянным дном.
Удалите любую лишнюю, лишнюю матросную среду, чтобы рыба была как можно ближе ко дну блюда. Используйте пластиковую пастерную пипетку, чтобы добавить достаточно теплой жидкой агросы, чтобы покрыть личинку. В то время как агрос харднес, используйте тонкие щипцы, чтобы сориентировать рыбу вентральной стороной вниз в центре блюда.
Затем добавляют в чашку два миллилитра регистрирующем раствора, содержащего 10 микромолярного панкурония бромида, чтобы блокировать нервно-мышечную передачу. Затем заполните микропипеттинг регистрирующим раствором и используйте усилитель патч-зажима в конфигурации зажима напряжения, чтобы измерить сопротивление электрода в ванне, чтобы подтвердить его правильное значение. Используя объектив 20x, расположите голову личинки в центральном поле зрения и опустите микропипет, чтобы достичь записывающего положения в оптической тектуме.
переключите усилитель патч-зажима на конфигурацию тока и зафиксируйте удерживающие токи до нуля миллиампер. Используя фильтр нижних частот в один килогерц, скорость сбора в один килогерц и цифровой коэффициент усиления 10, регистрируют спонтанную активность рыбы в течение 60 минут для определения базовых уровней активности. В конце исходной записи, на 143 микролитра 300 миллимолар на литр пентилететразола раствора в ванну, для конечной концентрации 20 миллимолар на литр.
Записывают нейронную активность животного в растворе пентиленететразола еще 120 минут. В течение базового периода регистрации, от четырех до шести дней после оплодотворения эпилептических моделей рыб данио демонстрируют более высокую распространенность спонтанных событий, в то время как контрольные рыбы несоответствуют очень мало колебаний. После применения пентиленетеразола как контроль несоответствий, так и эпилептические модели рыбок данио демонстрируют повышенное количество событий глубокой поляризации.
В течение первого периода после применения пентиленететразола наблюдается скорость 0,8 события в минуту как у животных, контролирующие несоответствие, так и у сбитых животных, для которых большинство событий имеют высокую амплитуду. В течение последнего периода ответа. Скорость событий деполяризации увеличивается примерно до одного события в минуту.
И большинство событий имеют низкую амплитуду. При выполнении нокдауна очень важно установить правильную дозу морфолино с помощью кривой реакции дозы и выполнить контроль, чтобы избежать неспецифической токсичности. Этот толчок позволил провести несколько последующих исследований, включая тестирование эффектов генетических или химических модификаторов.
А поведение рыбок данио и нейронная активность для понимания эффектов развития DC пять мутаций.
